Summary
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.
Abstract
Krebs Zelle Mobilität ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist der Zellbewegung und -invasive Untersuchung von großer Bedeutung. Migration-Assays bieten grundlegende Einsicht der Zellbewegung 2D Ebene, während Invasion Assays imitiert in-vivo Krebs Zelle Dislodgment von der ursprünglichen Website und Invasion durch die extrazelluläre Matrix mehr physiologisch relevant sind. Das aktuelle Protokoll sieht einen einheitlichen Workflow für Migration und Invasion Assays. Zusammen mit der integrierten automatischen mikroskopische Kamera für HD-Bilder in Echtzeit und integrierte Analyse-Modul gibt es Forscher eine zeitsparende, einfache und reproduzierbare experimentelle Option. Dieses Protokoll enthält auch Ersetzungen für Verbrauchsmaterialien und alternativen Analysemethoden für Benutzer zur Auswahl.
Introduction
Zelle Migration und Invasion sind wichtige biologische Prozesse, die normale Funktionen im menschlichen Körper, wie z. B. Wundverschluss, Invasion der Plazenta in der Gebärmutter und Brustdrüse Morphogenese1,2,3zu ermöglichen. Der menschliche Körper hat präzise und strenge Kontrolle dieser biologischen Ereignisse; Es gibt jedoch einige Ausnahmen. Bösartige Tumore können zum Beispiel dieses Sicherheitsmerkmal zu entgehen, weisen abnorme Proliferation und dringen in benachbarte Gewebe, die Metastasen genannt wird. Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs-in Verbindung stehenden Sterblichkeit4.
Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen, und ist die zweithöchste Todesursache krebsbedingte Todesursache bei Frauen in Industrieländern weltweit5. Brustkrebs stammt aus Leitungen oder Läppchen, die aus einer oder mehreren Schichten von epithelialen Zellen bestehen. In der normalen Brust halten Epithelzellen untereinander und der Basalmembran durch Membranproteine wie z. B. E-Cadherin und Integrine6. Jedoch invasiven Brustkrebs-Zellen ihre Polarität und Zell-Zell-Adhäsion, verloren haben und klassisch epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und die Fähigkeit erlangen, bewegen. Nach Paravasation diese Zellen bewegen sich über die extrazelluläre Matrix (ECM) und das Blutgefäß oder das lymphatische System, dann folgten Intravasation und metastasiertem Wachstum7eingeben. Das Verständnis der Mechanismen, mit denen dies geschieht, ist von großer Bedeutung, da Metastasen die häufigste Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle ist und eng mit Krebs verwandt ist Zelle Migration/Invasion. Um die Bewegung von Krebszellen zu visualisieren, sind Migration und Invasion Assays ideale Modelle für 2D und 3D Zellbewegung, bzw. studieren. Migration wird die Bewegung der Zellen direkt beurteilt, Invasion erfordert Interaktion mit der Mikroumgebung und die Fähigkeit, biologische Barrieren abbauen. Die zwei Prozesse sind nicht völlig unabhängig voneinander, wie Migration eine Anforderung der Invasion ist.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Migration und Invasion zu studieren. Wie von Kramer Et Al., Migration-Assays wie Wundheilung, überprüft Zaun und Mikro-Träger Assays generieren eine zellfreien Gegend um Zellen bezogen, Bewertung der Änderung des Bereichs zu ermöglichen; in der Erwägung, dass Transwell und Kapillare Assays auf die Anzahl der Zellen basieren, die auf einem Lockstoff8zu bewegen. Für Invasion Assays, eine ECM-Umgebung hat zum Beispiel mit ECM Gel oder Kollagen eingerichtet werden, und 3D Bewegung beurteilt werden kann, durch die Überwachung der Invasion Fläche, Distanz und Zelle zählt (z.B. Transwell Assay, Schnabeltiere Assay)8. Eine andere Art von Invasion Assay ist die Kombination der invasiven Zellen mit nicht-invasiven Zellen und beurteilen das Verhalten der invasiven Zellen (z. B. Sphäroid assays). Die oben genannten Methoden haben ihre vor und Nachteile und eine Weise, die leicht zugänglich, leicht zu wiederholen, und kombinieren Sie die Migration-Assay und Invasion-Assay in einem ähnlichen Workflow ist bevorzugt im experimentellen Design.
Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Zelle Migration und Invasion mit einer live-Cell-Imager. Es ist eine Echtzeit-Zelle Überwachungssystem installiert in einem Inkubator Standardzelle Kultur. High-Definition-Bilder entsprechend den eingestellten Intervalle und Messungen durch die Anwendung geeigneter Masken der Zellen und fluoreszierende Vorgaben Scannen dauert. Das Modul der Migration/Invasion Assay umfasst mit einem 96-poligen Scratch Tool, welches zur Herstellung von homogenerer Kratzer Wunden auf eine Zelle monomolekularen Film in eine 96-Well-Platte eignet. Der Mechanismus basiert auf in-vitro-Wunde heilen Assays, Überwachung 2D Zellbewegung auf einem Kunststoff oder beschichtete Oberfläche. Invasion oder 3D Bewegung über eine zusätzliche ECM innerhalb der Kratzer, die Wunde kann auch beurteilt werden. Ein kurze Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
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Protocol
Hinweis: Zwei Zelllinien sollte gesondert behandelt werden. Die folgenden Verfahren sollten auf eine einzelne Zelle Zeile angewendet werden, wenn nicht angegeben.
1. Optimierung der Zelldichte vor Verwundung
- Adhärente Zellen in T75 cm2 Gewebe Kulturflaschen auf ca. 80 % Kultur Zusammenfluss in Phenol-rot frei Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 200 mM L-Glutamin und 2 µg/mL Insulin bei 37 ° C mit 5 % CO2 (ergänzt "Standard Inkubationsbedingungen für die meisten Krebszelllinien, Kultur Formulierungen sind Zelle Zeile-abhängig).
- Entfernen der Nährmedien pipettieren Sie in einen Abfallbehälter. Pipettieren 2 mL vorgewärmten 0,1 % Trypsin-EDTA kurz Cell Monolayer und Pipettieren abzuspülen. Fügen Sie ein weiteres 2 mL 0,1 % Trypsin-EDTA und legen Sie die Flasche unter standard Inkubationsbedingungen bei 37 ° C für 5 min.
- Klopfen Sie leicht den Kolben um Loslösung der Zellen zu gewährleisten und dann 10 mL vorgewärmten Kulturmedien, die proteolytische Reaktion zu stoppen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Spin-down bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Sorgfältig entfernen, des Überstands ohne Rühren die Zelle Pellet und erneut mit einem anderen 10 mL vorgewärmten Nährmedien.
2. zählen Zelle mit einem automatisierten Zelle Zähler (oder zählen Methoden)
- Verdünnte 200 µL resuspendierte Zellsuspension mit 800 µL 1 x Dulbeccos Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (DPBS) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
- Der Zelle-Zähler beimessen Sie einen 60 µm Zelle Graf Sensor, halten Sie die ein/aus und Zusammenführen Sie die Spitze in der Zellsuspension. Lassen Sie langsam den Knebel bis die Zellsuspension erfolgreich in den Sensor gezogen wird. Zellkonzentration erscheint in Zellen/mL.
- Berechnen Sie die Anzahl von Zellen in der 10 mL Zellsuspension.
(3) Cell Plating
- Platte Zellen in einem Bereich von Zelldichten (40.000-90.000 Zellen/Na) in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte.
-
Legen Sie die Platte in den live-Cell-Imager, und planen Sie scannen alle 2 h für 24 h.
- Klicken Sie in der Software auf Zeitplan scannt der Aufgabenliste. Bestimmen Sie im Bereich Schublade Setup die Position der Platte, klicken Sie auf Add Schiff und wählen Sie den Teller. Im Bereich Scannen Setup wählen oder Scanmuster gemäss den experimentellen Platte-Einstellungen bearbeiten und Scan-Typ als Standardfestlegen.
- Rechtsklick auf der Zeitachse und wählen Sie Intervalle festgelegt. 2 h bei einem 24-h-Zeitplan Scannt jeden hinzufügen soll. Klicken Sie auf anwenden.
4. bestimmen Sie die optimale Zelle Aussaat Dichte für die Migration-Assay
- StOp Scannen nach 24 h, Anwenden des Zusammenflusses Verarbeitung Analyse-Tool auf die HD-Phase Kontrast Bilder automatisch erfasste, und erzeugen eine Zelle Verbreitung Kurve gegen die Zeit.
- Bestimmen Sie 3-6 repräsentative Bilder und legen Sie sie in eine neue Bildersammlung.
- Eine richtige Maske als Verarbeitung Definitionzu bestimmen.
- Einen Analyse-Auftrag zu starten.
- Optimierte Zelldichte nach Zusammenfluss gegen die Zeit zu bestimmen (ca. 100 % Zusammenfluss innerhalb von 6-18 h je nachdem, wann die Migration-Assay beginnt).
Hinweis: Zeit, die es braucht, um die Zellen zu Confluence wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung.
(5) Tage 1 und 2: Vorbereitung auf die Migration und Invasion Assays
-
An Tag1 Mantel der Platte für Invasion-Assay.
Hinweis: ECM Gel sollte immer behandelt werden, auf Eis und mit Spitzen, die über Nacht in den Kühlschrank gelegt haben.- ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 100 µg/mL zu verdünnen und 50 µL verdünnter ECM Gel/Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen.
- Ort der Platte am standard Inkubationsbedingungen Übernachtung.
- Am 2. Tag aspirieren Sie vorsichtig die überschüssige Medien. Zellen mit optimierter Zelldichten in 2 96-Well-Platten für die Migration-Assay (unlackiert) bezeichnet und die Invasion-Assay (beschichtet) in Triplicates nach Ziffern 1-3 am späten Nachmittag (in das aktuelle Protokoll, optimierte seeding dichten für Teller ZR75-1 und MDA-MB-231 waren 90.000/gut und 50.000/gut, beziehungsweise).
- Legen Sie über Nacht im standard Inkubationsbedingungen Platten.
6. Tag 3: Wunde kratzen
- Sprühen Sie und wischen Sie das Kratzen Werkzeug und 2 Boote mit 70 % Ethanol waschen, bevor diese in die Biosicherheit Schrank platziert. Füllen Sie das Waschen Boot 1 und 2 bzw. mit genau 45 mL steril (autoklaviert) destilliertes Wasser und 70 % Ethanol.
- Legen Sie für die Sterilisation kratzen Werkzeug Stimmstock (oben) auf Boot 1 und 2 für 5 min waschen.
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Beginnen Sie mit der Migration-Assay-Platte.
- Bewegen Sie die Platte mit Zellen aus dem Inkubator und sicherstellen Sie, dass keine Brunnen trocken zur Beschädigung des Werkzeugs Kratzer zu vermeiden ist. Entfernen Sie die Abdeckung der Platte legen Sie in der Grundplatte Inhaber des Werkzeugs kratzen und legen Sie das Oberteil auf das Unterteil vorsichtig durch die Führung der Dübel. Drücken Sie und halten Sie den schwarzen Hebel, und inzwischen heben Sie vorsichtig den Stimmstock. Lücken in jede Vertiefung sind meist mit bloßem Auge und unter dem Mikroskop sichtbar.
- Schnell die Stifte im Wasser einweichen; Dies ist ausreichend zu reinigen das Kratzen Werkzeug vor die Invasion-Assay-Platte zu kratzen, wenn Platte Setup identisch ist. Andernfalls wiederholen Sie den Sterilisation mit sterilem destilliertem Wasser und dann mit 70 % igem Ethanol für 5 Minuten.
- Waschen Blätter der Platte 1 oder 2 Mal mit vorgewärmten Nährmedien, freistehende Zellen oder Zellen zu vermeiden Wiederanbringen zum Brunnen.
- Fügen Sie 100 µL der frischen warmen Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen mit oder ohne Behandlung.
-
Zusätzliche Schritte für Invasion Assay.
- Platzieren Sie die Invasion-Assay-Platte bei 4 ° C für 5 min zu equilibrate und aspirieren Sie sorgfältig die kalten Medien.
- ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 5 mg/mL zu verdünnen, 50 µL verdünnter ECM Gel in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen und unter standard Inkubation für 30 min statt.
- Fügen Sie 100 µL der erwärmten Medien mit oder ohne Prüfung Verbindungen hinzu.
- Die Platte in live-Cell-Imager und lassen Sie es für 5 min. Wählen Sie Schiffstyp als Imagelock Platte equilibrate. Scan-Typ als Wunde kratzenfestlegen Sie, wählen Sie oder bearbeiten Sie Scan Pattern nach der experimentellen Platte-Setup (1 Bild/gut und breit-Modus) und planen Sie, 24-h wiederholen scannen alle 1-2 h 72 h bis die Wunden verheilt sind.
- Um das Kratzen Werkzeug zu reinigen, setzen die oberen Stimmstock in jedem der folgenden Lösungen (45 mL in Wasch-Boote) für 5 min.: 0,5 % Waschmittel 1 (siehe Tabelle der Materialien), 1 % Waschmittel 2 (siehe Tabelle der Materialien), sterilem destilliertem Wasser und 70 % Ethanol. Legen Sie das Kratzen Werkzeug wieder auf die Bodenplatte und Store in einer staubfreien Umgebung.
7. die Datenanalyse
- Scannen der dafür vorgesehenen Platte, nachdem die Wunden verheilt sind, indem die experimentelle Platte auf die Schublade Setup auswählen und auf Entfernen Schiffzu stoppen.
- Sammeln Sie 3 bis 6 repräsentative Bilder umfassen eine Reihe von soliden Prozentsätze, einschließlich Bilder rechts, nachdem die Wunde erfolgter Schließung gewickelt um 10 % und 50 %.
- Verwenden Sie Segmentierung, Bereinigung und Filter um festzustellen, eine ordnungsgemäße Verarbeitung Definition entsprechenden Scratch Wunde Maske und Confluence Maskeanwenden. Verwenden Sie Vorschau Strom/All , um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen.
- Starten Sie die Analyse-Auftrag.
- Daten können für weitere Analysen exportiert oder innerhalb der Software analysiert werden. Drei Kennzahlen der Software können verwendet werden, um HD-Phasenbilder bewerten: Wunde Breite (µm), Wunde Zusammenfluss (%) und relative Wunde Dichte (%). Vergleiche werden im folgenden Abschnitt besprochen.
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Representative Results
Diese Migration/Invasion Assay basiert auf die heilende Wunde-Assay, wertet die Rate der Zellen in einem zellfreien Bereich durch die Kratzer 96-Pin-Werkzeug erstellt. Der Unterschied zwischen Migration und Invasion Assays sind, dass Migration Maßnahme Zellen verschieben auf die Gewebekultur behandelt Kunststoff Oberfläche und Invasion Maßnahmen Zellen bewegen über ECM Gel Proben.
Die Scratch Tool dient zur konsequenten kratzen Wunden in der dafür vorgesehenen Platte machen und live-Cell-Imager wurde entwickelt, um hochauflösende Bilder in Echtzeit mit dem kratzen Wunden in der Mitte nehmen. Die beiden Brust-Krebszelle Linien in das aktuelle Protokoll verwendet ZR75-1 und MDA-MB-231, kategorisiert als luminalen B und triple negativen Subtypen bzw.9. Die kratzen Wunden von den 96-poligen Scratch Tool generiert werden häufig zwischen 700-900 µm aber können variieren zwischen den verschiedenen Zelllinien (Abbildung 2).
Für die Migration-Assay, drei Kennzahlen stehen zur Verfügung: (1) Wunde Breite (µm) ist der durchschnittliche Abstand zwischen den Blättern der Zelle neben der Wunde (Abbildung 3). (2) Wunde Confluence (%) ist der Zusammenfluss der verletzte Bereich (Abbildung 3). Die ideale erste Wunde Zusammenfluss sollte in der Nähe von 0 %. (3) relative Wunde Dichte (%) ist ein Hintergrund subtrahiert Algorithmus [% relativ Wunde Dichte = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t zum Zeitpunkt t, w = = Dichte der Wundregion c = Dichte der Zelle Region], Messung der Dichte von der Wundregion bezogen auf die Dichte der Zelle Region.
Drei förderfähigen Metriken können basierend auf den Anforderungen erreicht werden. Die relative Wunde Dichte und Wunde Zusammenfluss bedeuten die Geschwindigkeit der Zellen auf den Kratzer Wunde Fläche, und fast in beiden Zelllinien überlappen. Aber die beiden Zellinien zeigte sehr unterschiedliche Wundheilung Fähigkeiten, wo am Ende (ca. 50 h) der Wunde Heilungsprozess von MDA-MB-231-Zellen, ZR75-1 etwa 50 % Abdeckung (die beiden Metriken oben) gewickelt hatte und mehr als 400 µm verbleibende Breite Wunde, zeigt eine geringere Migration Fähigkeit der ZR75-1-Zellen (Abbildung 4).
Die Migration von Verhaltensweisen der zwei Zelltypen unterschieden und anhand der aufgenommenen Bilder verglichen werden können. Lamellipodia (Blebbing Vorsprünge) verzeichneten MDA-MB-231 Zellen an der Vorderseite der Migration zu Beginn der Wanderung, die ein typischen Zeichen des Zytoskeletts Neuordnung war, Regie Zelle Bewegung in Richtung der zellfreien Region10 (Abbildung 5 ). ZR75-1-Zellen zeigten keine Anzeichen von Zellwanderung am gleichen Zeitpunkt (Abbildung 5).
Die metrische Relative Wunde Dichte wird vom Hersteller für Zellinvasion, empfohlen, da es ein 3D Assay ist und Zusammenfluss basierende Analyse nicht anwendbar ist. Innerhalb von 50 h war die relative Wunde Dichte von MDA-MB-231 Zellen gesättigt (100 %), während die relative Wunde Dichte des ZR75-1-Zellen im Laufe der Zeit unverändert blieb unter Angabe der sehr invasive Phänotyp von MDA-MB-231-Zellen und die nicht-Invasivität der ZR75-1 Zellen ( ( Abbildung 6).
MDA-MB-231-Zellen verhalten sich auch anders während der Invasion durch ECM Gel (Abbildung 7). Im Vergleich zu Zellen mit Lungenblase Migration vorne, zeigten eindringenden Zellen eine längliche Morphologie mit führenden Vorsprünge.
Abbildung 1 : Workflow von Migration und Invasion Probe in das aktuelle Protokoll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Performance des Werkzeugs Kratzer auf Brust Krebszelle Linien ZR75-1 und MDA-MB-231 (obere Abdeckung) mit der gemessenen ursprüngliche Wunde Breite und ursprüngliche Wunde Zusammenfluss (untere Leiste). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Migration Assay illustriert von HD Kontrast Phasenbilder und gemischten Modus mit Masken im MDA-MB-231. Blau, neu gewickelt; gelb, die Kratzer, die Wunde umgebenden Zellen; Rosa, Zellen, die in den Kratzer Wunde an 24 h nach vorne verschoben. Skalieren von Balken = 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Vergleich der drei Algorithmen (Wunde Breite, relative Wunde Dichte und Wunde Zusammenfluss von Brustkrebszelllinien ZR75-1 (links) und MDA-MB-231 (rechts). Alle Experimente repräsentieren dem Mittelwert der drei unabhängigen Experimenten, ± S.D. Maßstabsleisten = 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Migration vor der ZR75-1 und MDA-MB-231 Zellen 4 h nach Kratzer. Pfeile, Lamellipodia Migration vorne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Quantifizierung der Invasion mit metrischen Wunde Anteil (%) der Brust-Krebs-Zell-Linie ZR75-1 (links) und MDA-MB-231 (rechts). Alle Experimente repräsentieren den Mittelwert der drei unabhängigen Experimenten, ± die S.D. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Verschiedenen zellulären Eigenschaften der MDA-MB-231 Zellen in Migration (links) und Invasion (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Ein Beispiel für einen Kratzer, Wunde, die durch das integrierte Migration Modul aus einer 96-Well-Platte analysiert werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Migration und Invasion sind wichtige Parameter für die Mobilität von Krebszellen zu beurteilen. Mithilfe von 96-poligen Scratch Tool ist es möglich, Wundheilung Assays in 2D und 3D gleichzeitig durchzuführen. Automatisches Scannen zu erleichtern, bietet eine stabile Zelle Kultur Umgebung mit minimaler Unterbrechung der Scratch Test durchgeführt mit dem 96-poligen Scratch Tool bietet neben konsequenten kratzen Wunden, ermöglicht Experimente, die robuster sind und reproduzierbar sind. 96-Well-Plattenformat bietet zusätzliche Optionen entweder die Zahl der Zell-Linien oder verschiedene medikamentöse Behandlungen. Darüber hinaus können Zellveränderungen Morphologie und dynamische Bewegung zur weiteren Analyse aufgezeichnet werden.
Migration/Invasion Assay soll leicht mit ein paar Voraussetzungen anwendbar. Eine konfluierende Zelle Monolage ist kritisch vor Verwundung um eine gerichtete Zelle Bewegung in Richtung der Lücke zu gewährleisten. Es wird daher dringend empfohlen, Zelle Dichte Aussaat zu optimieren und ein Zeitrahmen zwischen 6-18 h ist in der Regel ideal. Die Möglichkeit der Befestigung an der Oberfläche und die Proliferationsrate experimentelle Zellen wirkt sich dieser Zeitrahmen. Verlängerte Inkubation Zeit kann führen zu starken Zellezelle Adhäsion und krummen bilaterale Zelle Fronten durch Entfernung der Zelle Blätter zu generieren. Eine Biomatrix-Beschichtung werden mit weniger Klebstoff Zell-Linien, um die Wartezeit zu verringern. Zellen können vor Verwundung ausgehungert werden. Hunger-Timing ist ähnlich wie Timing, kratzen die beim Zusammenfluss fast 100 % erreicht ist, und die Hunger-Medien und Dauer sind Zelltyp abhängig. Zellen können auch transfiziert, aber Dichte Aussaat muss über einen längeren Zeitraum vor Verwundung, ermittelt werden unter Berücksichtigung der Inkubationszeit des Transfection Prozesses. Verwundung kann innerhalb weniger Sekunden mit dem 96-poligen kratzen Werkzeug erreicht werden. Definiert Größe Stifte garantieren eine präzise Migration/Invasion Startlinie und Entfernung. Wichtig ist, muss die oberen und unteren Abschnitte gut abgestimmten einen voller Kratzer über die Brunnen, abschließen, damit die live-Cell-Bilder entweder Terminal der kratzen Wunden gehören nicht. Die kratzen Wunden können leicht mit bloßem Augen auf die konfluierende Zelle Monolage beobachtet werden und können schnell unter dem Hellfeld-Mikroskop überprüft werden. Waschen der Brunnen sollte sofort durchgeführt werden und sanft zu Wiederbefestigung der Zellen verdrängt und Entfernung von bilateralen Zellen. Reicht ein waschen, um die gewünschte Zelle-freie Zone zu bereinigen, gibt es keine Notwendigkeit für eine zusätzliche Wäsche.
Migration-Assays können durch Zugabe von Nährmedien mit oder ohne Behandlungen abgeschlossen und sind bereit zum Scannen, während einige zusätzliche Schritte erforderlich sind, um für eine Invasion Assay berücksichtigt werden. Im Gegensatz zu Zellwanderung durchdringen eindringende Zellen ECM, die genauer in Vivo Zellbewegung besser widerspiegelt. Der Prinzipal des aktuellen Protokolls ist es, eine ECM umgeben-Umgebung mithilfe von ECM Gel generieren. Zellen sind auf ECM Gel beschichtet Brunnen und nach Verwundung ausgesät, ECM-Gel wird auf die Zellen und die Kratzer Wunde gelegt. Beim Umgang mit ECM Gel ist es besser, alles kalt, Gelierung zu vermeiden zu halten. Ungleich verteilte ECM Gel kann Probleme verursachen, wenn das Mikroskop zu konzentrieren. Aufgrund der viskosen ECM Gel ist es möglich, Bläschen zu erzeugen, aber die Bläschen können leicht durch Absaugen entfernt werden 70 % Ethanol durch eine Sprühflasche. Um feine aber nicht übertrieben Spray zu generieren, einfach abschrauben der Kappe der Sprühflasche und Sprühen aus der überschüssige 70 % Ethanol in das Stroh an anderer Stelle zeigen. Durch Spritzen in einem Abstand oben und horizontal auf der Platte, ist das gut 70 % Ethanol Spray ausreichen, um die Luftblasen zu beseitigen.
Der erste Scan sollte so bald wie möglich nach Verwundung, um die anfängliche zellfreie Wundgebiet, erfassen beginnen und dies ist wichtig für die Festlegung der Kriterien für die Analyse. Die Scan-Intervalle hängen die Zelltyp mehr invasive Zelllinien eine raschere Wunde Verschluss aufweisen.
Diese Migration/Invasion Anwendung ist relativ einfach, und mithilfe der integrierten Analyse-Modul kann Zellbewegung kinetisch mit 3 Kennzahlen dargestellt werden: die Wunde Breite, Wunde Zusammenfluss und die relative Wunde Dichte (Abbildung 3). Alle drei kann verwendet werden, um Migration zu bewerten. Wunde breite beschreibt die durchschnittliche Entfernung in µm, wenn die bilateralen Zelle Blätter relativ parallel verschieben und ist unabhängig von der ursprünglichen Wunde Grenze. Wunde Zusammenfluss relative Wunde Dichte, im Gegenteil, erfordern die ursprüngliche Wunde-Grenze in der Berechnung und der Einmündung in das Wundgebiet und die Zelldichte im Verhältnis zu den unverletzten Bereich bzw. zu beschreiben. Für die Invasion-Assay ist relative Wunde Dichte empfohlen, da es das Wundgebiet in Bezug auf die bilateralen Zelle Blätter berechnet. Leser können diejenige auswählen, die ihren Bedürfnissen am besten entspricht.
Dieser Kratzer Wunde Migration/Invasion Assay kann bequem sein, aber es erfordert das 96-poligen kratzen Werkzeug, benannten Platten und der Leben-Zelle-Imager mit dem integrierten Migration/Invasion-Modul, die typische Ergebnisse, die in diesem Protokoll zu reproduzieren und Diese können teuer werden. Kostengünstige Substitutionen wie einen flachen Boden multiwell 96-Well-Platte eingesetzt werden und können anständige kratzen Wunden (Daten nicht gezeigt) erzeugen. Jedoch konnte die Leistung des Werkzeugs Kratzer nicht so gut wie bei der benannten Teller diente, und manche Wunden nicht werden durch den Scan-Modus (Abbildung 8), so abgeholt konnte richtig definieren die anfängliche Wundfläche. Darüber hinaus kann das Scratch-Tool verwendet werden, kratzen Wunden mit Analyse entweder manuell, durch Bildbearbeitungsprogramme, oder mit anderen Endpunkt Visualisierung und Analyse-Tools zu erstellen. Sie bieten mehr Flexibilität, um die ersten Wunden zu finden und sind daher nicht nur an den dafür vorgesehenen Platten. Auf der anderen Seite ist die Migration/Invasion-Assay kombiniert mit live Cell Imaging in das aktuelle Protokoll weniger zeitaufwändig und weniger fehleranfällig. Dies könnte besonders für experimentelle Konsistenz und erhöhte Effizienz.
Zusammenfassend ist dieser Migration/Invasion-Assay, schnell, einfach und robust. Benutzer können wählen Sie aus unserem Protokoll und andere basierend auf ihren Bedarf und jeden Geldbeutel.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir würden gerne unsere finanzielle Unterstützung durch die Bloomfield Group Foundation durch Hunter Medical Research Institute (Angestiegene 13-02) zu erkennen. X.Z stützt sich auf eine APA Stipendium der University of Newcastle und der HCRA Biomarker Flaggschiff Promotionsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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