Summary
L'attuale protocollo descrive un metodo integrato, indagando la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione su un'unica piattaforma in tempo reale, fornendo un'opzione facilmente riproducibile e tempo efficiente per studiare la morfologia e la mobilità delle cellule.
Abstract
Mobilità delle cellule di cancro è fondamentale per l'avvio della metastasi. Di conseguenza, indagine del movimento cellulare e capacità invasiva è di grande importanza. Saggi di migrazione forniscono conoscenza base del movimento cellulare a un livello 2D, considerando che le analisi di invasione sono più fisiologicamente rilevanti, che imita il dislodgment delle cellule tumorali in vivo dal sito originale e invadendo attraverso la matrice extracellulare. Il protocollo attuale prevede un unico flusso di lavoro per saggi di migrazione e invasione. Insieme con la fotocamera integrata di microscopica automatizzata per immagini HD in tempo reale e modulo built-in analisi, dà i ricercatori un tempo-efficiente, semplice e riproducibile opzione sperimentale. Questo protocollo comprende anche le sostituzioni per i materiali di consumo e metodi di analisi alternativa per gli utenti da scegliere.
Introduction
Invasione e migrazione cellulare sono importanti processi biologici che permettono le funzioni normali del corpo umano, come la chiusura della ferita, invasione di placenta in utero e della ghiandola mammaria morfogenesi1,2,3. Il corpo umano ha un controllo preciso e rigoroso di questi eventi biologici; Tuttavia, ci sono alcune eccezioni. I tumori maligni, ad esempio, sono in grado di sfuggire questa salvaguardia, esporre la proliferazione anormale e invadere nel tessuto limitrofo, che è chiamato metastasi. La metastasi è la causa principale della mortalità legata al cancro4.
Cancro al seno è il più comunemente diagnosticato cancro nelle donne ed è la seconda più alta causa di morte per cancro tra le donne in paesi sviluppati in tutto il mondo5. Cancro al seno è originario di condotti o lobuli costituiti da uno o più strati di cellule epiteliali. Nella mammella normale, cellule epiteliali aderiscano uno a altro e alla membrana basale attraverso proteine di membrana come E-caderina e integrine6. Tuttavia, cellule di carcinoma mammario invasivo hanno perso la loro polarità e adesione cellula-cellula e classicamente subiscono epiteliali transizione mesenchimale (EMT) e acquisiscono la capacità di muoversi. Dopo lo stravaso, queste cellule possono attraversare la matrice extracellulare (ECM) e immettere il vaso sanguigno o il sistema linfatico, seguita poi da intravasation e crescita metastatica7. La comprensione dei meccanismi con cui questo si verifica è di grande importanza, dal momento che è la causa più comune di mortalità legata al cancro ed è strettamente legata al cancro metastasi delle cellule migrazione/invasione. Per visualizzare il movimento delle cellule tumorali, saggi di migrazione e invasione sono modelli ideali per studiare il movimento delle cellule 2D e 3D, rispettivamente. Migrazione valuta direttamente il movimento delle cellule, mentre l'invasione comporta l'interazione con il microambiente e la capacità di degradare le barriere biologiche. I due processi non sono completamente indipendenti uno da altro, come la migrazione è un requisito dell'invasione.
Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare la migrazione e l'invasione. Come Recensito da Kramer et al., saggi di migrazione come la guarigione delle ferite, recinzione e saggi di micro-elemento portante generano una zona senza cellula per consentire alle cellule di muoversi in, valutare il cambiamento di zona; considerando che, in saggi di transwell e capillare sono basati sul numero di cellule che si muovono verso un attractant8. Per le analisi di invasione, un ambiente di ECM ha da istituire con ECM gel o collagene per esempio, e movimento 3D può essere valutata controllando i conteggi di zona, la distanza e la cella del invasione (ad es. analisi di transwell, analisi della platypus)8. Un altro tipo di analisi di invasione è di combinare le cellule invasive con cellule non-invasivo e valutare il comportamento delle cellule invasive (ad es. sferoide saggi). I metodi di cui sopra hanno il loro pro e contro e un modo di facile approccio, facile da ripetere e di combinare l'analisi di migrazione e invasione assay in un flusso di lavoro simile è preferenziale nel disegno sperimentale.
Questo protocollo descrive la misura della migrazione cellulare e invasione usando un imager di cellule vive. È un cellulare in tempo reale monitoraggio sistema installato in un'incubatrice di coltura cellulare standard. Prende immagini ad alta definizione secondo il set di intervalli e misurazioni di scansione applicando maschere appropriate per le celle o gli obiettivi fluorescenti. Il modulo di analisi di migrazione/invasione include l'utilizzo di uno strumento di gratta e Vinci 96-pin, che è adatto a fare ferite omogenee gratta e Vinci su un monostrato di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Il meccanismo si basa sulla ferita in vitro guarigione dosaggi, monitoraggio movimento 2D cellulare su una plastica o rivestimento. Può essere valutato anche invasione o movimento 3D attraverso un ulteriore ECM entro il graffio della ferita. Un breve flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Due linee cellulari devono essere maneggiate separatamente. Le procedure seguenti dovrebbero essere applicate a una singola cella linea se non specificate.
1. ottimizzare la densità delle cellule prima del ferimento
- Coltura di cellule aderenti in beute di coltura del tessuto di T75 cm2 a circa l'80% confluenza in di rosso fenolo libero Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 200 mM L-Glutammina e 2 µ g/mL insulina a 37 ° C con 5% CO2 ( condizioni di incubazione standard per la maggior parte delle linee cellulari di cancro, formulazioni di cultura sono cella linea-dipendente).
- Rimuovere il supporto di cultura pipettando fuori un contenitore per rifiuti. Pipettare 2 mL di pre-riscaldato 0,1% tripsina-EDTA a risciacquare brevemente il monostrato cellulare e dispensare. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,1% e mettere il pallone in condizioni standard di incubazione a 37 ° C per 5 min.
- Picchiettare delicatamente la boccetta per garantire il distacco delle cellule e quindi aggiungere 10 mL di terreno di coltura pre-riscaldato per arrestare la reazione proteolitica.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA). Attentamente rimuovere il supernatante senza agitazione del pellet e risospendere con un altro 10 mL di coltura pre-riscaldato.
2. contare il numero di cellulare utilizzando un contatore di cellule automatizzato (o un qualsiasi metodo di conteggio)
- Diluire 200 µ l di sospensione cellulare sedimento con 800 µ l di 1 x fosfato di Dulbecco tampone salino (DPBS) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
- Collegare un sensore di conteggio delle cellule di 60 µm per il contatore di cella, tenere premuto il toggle e unire la punta in una sospensione cellulare. Rilasciare lentamente la leva fino a quando la sospensione cellulare viene disegnata correttamente nel sensore. Concentrazione cellulare viene visualizzata in cellule/mL.
- Calcolare il numero di cellule in sospensione delle cellule di 10 mL.
3. cellula placcatura
- Cellule di piastra a una gamma di densità delle cellule (40.000-90.000 cellule/pozzetto) in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti.
-
Inserire la piastra l'imager di cellule vive e pianificare l'analisi ogni 2 h per 24 h.
- Nel software, fare clic su pianificazione scansioni dall'elenco attività. Nel riquadro Configurazione di cassetto, determinare la posizione della piastra, fare clic su Aggiungi nave e scegliere il tipo di piatto. Nel riquadro Configurazione di scansione , scegliere o modificare il modello di scansione secondo il programma di installazione di piastra sperimentale e impostare Tipo di scansione come Standard.
- Fare clic con il pulsante destro sulla Timeline e selezionare Impostare intervalli. Impostare Scansioni aggiungere ogni 2 h a una pianificazione di 24 h. Fare clic su applica.
4. determinare la cella ottima densità di semina per il dosaggio di migrazione
- Stop scansione dopo 24 h, si applicano alla confluenza elaborazione analysis tool per le immagini di contrasto HD-fase raccolte automaticamente e generare una curva di proliferazione delle cellule contro il tempo.
- Determinare immagini rappresentative di 3-6 e metterli in una nuova Raccolta di immagini.
- Determinare una maschera adeguata come Definizione di elaborazione.
- Avviare un processo di analisi.
- Determinare la densità delle cellule ottimizzato secondo confluenza contro il tempo (circa il 100% confluenza entro 6-18 h a seconda di quando inizia il test di migrazione).
Nota: Quanto tempo che ci vuole per crescere le cellule a confluenza varia a seconda della diluizione di semina.
5. i giorni 1 e 2: preparazione per la migrazione e invasione saggi
-
Il giorno 1, rivestire la piastra per analisi di invasione.
Nota: gel di ECM devono essere trattati su ghiaccio e con le punte che sono stati collocati in frigorifero durante la notte.- Diluire il gel ECM con terreni di coltura ghiacciato a 100 µ g/mL e aggiungere 50 µ l di diluito ECM gel/media nei pozzetti designati.
- Posizionare la piastra alle condizioni standard di incubazione durante la notte.
- Il giorno 2, aspirare delicatamente il terreno in eccesso. Piatto di cellule con densità ottimizzata delle cellule in 2 piastre da 96 pozzetti destinate per il dosaggio di migrazione (non rivestito) e l'analisi di invasione (rivestito) in triplici copie seguendo le sezioni 1-3 nel tardo pomeriggio (nel protocollo corrente, densità di semina ottimizzato per ZR75-1 e MDA-MB-231 erano 90.000/pozzetto e 50.000/pozzetto, rispettivamente).
- Posto piastre alle condizioni standard di incubazione durante la notte.
6. giorno 3: Ferita zero
- Spruzzare e pulire lo strumento gratta e Vinci e 2 barche con etanolo al 70% di lavaggio prima di metterli nella biosicurezza armadietto. Riempire la barca di lavaggio 1 e 2 con esattamente 45 mL di acqua distillata, acqua e 70%, etanolo, sterile (in autoclave), rispettivamente.
- Per la sterilizzazione, posizionare il blocco pin strumento gratta e Vinci (in alto) il lavaggio barca 1 e 2 per 5 minuti ciascuno.
-
Iniziare con la piastra di test di migrazione.
- Spostare la piastra che contiene cellule dall'incubatrice e assicurarsi che nessun pozzo è asciutto per non danneggiare lo strumento gratta e Vinci. Rimuovere il coperchio e inserire nel porta-piastra di base dello strumento gratta e Vinci e posizionare con cura la parte superiore sulla parte di base guidando tasselli. Premere e tenere premuto la leva nera e nel frattempo sollevare con cautela il blocco pin. Lacune in ciascun pozzetto sono di solito visibili ad occhio nudo e sotto il microscopio.
- Immergere rapidamente i perni in acqua; Questo è sufficiente per pulire lo strumento gratta e Vinci prima di graffiare la piastra di dosaggio di invasione se la piastra è identico. In caso contrario, ripetere i passaggi di sterilizzazione con acqua distillata sterile e poi con etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno.
- Lavare i tempi piatto 1 o 2 con mezzi di coltura pre-riscaldato per evitare indipendente celle o cella fogli riattaccare al pozzo.
- Aggiungere 100 µ l di fresco caldo media nei pozzetti designati con o senza trattamenti.
-
Passaggi aggiuntivi per analisi di invasione.
- Posizionare la piastra di dosaggio di invasione a 4 ° C per 5 min equilibrare e aspirare accuratamente i media freddi.
- Diluire il gel ECM con terreni di coltura ghiacciato a 5 mg/mL, aggiungere 50 µ l di gel di ECM diluiti nei pozzetti designati e posto sotto standard incubazione per 30 min.
- Aggiungere 100 µ l di media riscaldato-up con o senza prove composti.
- Posizionare la piastra in cellule vive imager e lasciarlo equilibrare per 5 min. Scegli Tipo di imbarcazione come piastra di imagelock. Impostare Tipo di scansione come Scratch ferita, scegliere o modificare Pattern di scansione secondo il programma di installazione di piastra sperimentale (1 immagine/pozzetto e modalità wide) e pianificare il 24-h ripetere analisi ogni 1-2 h per 72 h fino a quando le ferite sono guarite.
- Per pulire lo strumento gratta e Vinci, mettere il blocco perno superiore in ciascuna delle seguenti soluzioni (45 mL in barche di lavaggio) per 5 min: 0,5% detergente 1 (Vedi Tabella materiali), 1% detergente 2 (Vedi Tabella materiali), sterile distillata acqua e 70% di etanolo. Posizionare l'utensile graffio indietro sulla sua piastra di base e archivio in un ambiente privo di polvere.
7. analisi dei dati
- Interrompere la scansione la piastra designata dopo tutte le ferite sono guarite scegliendo la piastra sperimentale sul Cassetto installazione e facendo clic su Rimuovere la nave.
- Raccogliere immagini rappresentative di 3-6 si estende in un intervallo di percentuali audio, tra cui immagini direttamente dopo che è stato fatto la ferita, chiusura della ferita del 10% e 50%.
- Per determinare una definizione corretta elaborazione, utilizzare Segmentazione regolazione, pulizia e filtri per applicare appropriato Scratch ferita maschera e Maschera di confluenza. Utilizzare l'Anteprima di corrente/tutti per visualizzare la precisione delle maschere.
- Avviare il processo di analisi.
- Dati possono essere analizzati all'interno del software o esportati per ulteriori analisi. Tre metriche fornite dal software possono essere utilizzati per valutare le immagini HD-fase: ferita confluenza di larghezza (µm), ferita (%) e la densità relativa ferita (%). I confronti saranno discussi nella sezione seguente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questa analisi di migrazione/invasione è basata su analisi guarigione della ferita, che valuta il tasso delle cellule in movimento in un'area senza cellula creata dallo strumento scratch 96-pin. La differenza tra i saggi di migrazione e invasione sono che la migrazione dosaggi celle di misura lo spostamento su coltura di tessuti trattata plastica superficie invasione misure delle cellule e del movimento attraverso gel di ECM.
Lo strumento di gratta e Vinci è progettato per rendere coerente ai graffi ferite nella piastra designata e le cellule vive imager è progettato per prendere in tempo reale immagini ad alta risoluzione con le ferite di gratta e Vinci nel mezzo. Le due linee utilizzate nel protocollo corrente sono ZR75-1 e MDA-MB-231, classificato come luminal B delle cellule di cancro del seno e triplo negativo i sottotipi rispettivamente9. Le ferite di gratta e Vinci generate dallo strumento 96-pin gratta e Vinci sono comunemente tra 700-900 µm, ma possono variare tra le diverse linee cellulari (Figura 2).
Per il dosaggio di migrazione, vengono forniti tre metriche: (1) larghezza della ferita (µm) è la distanza media tra strati delle cellule al lato della ferita (Figura 3). (2) confluenza di ferita (%) è la confluenza all'interno dell'area ferentesi (Figura 3). La confluenza di ferita iniziale ideale dovrebbe essere quasi 0%. (3) ferita relativa densità (%) è un algoritmo di sfondo-sottratto [% relativa ferita densità = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = al tempo t, w = densità della regione di ferita c = densità della cella regione], misurare la densità della regione ferita rispetto la densità della regione delle cellule.
Tre metriche ammissibili possono essere realizzati in base alle esigenze. La densità relativa ferita e ferita confluenza implicano la velocità delle cellule occupando l'area ferita gratta e Vinci, e quasi si sovrappongono in entrambe le linee cellulari. Ma le due varietà di cellula ha mostrato la ferita molto diversa abilità, di guarigione dove al completamento (circa 50 h) della ferita processo delle cellule MDA-MB-231, ZR75-1 cellule di guarigione in circa il 50% era ferita in copertura (le due metriche sopra) e oltre 400 µm restanti ferita larghezza, che indica una bassa capacità di migrazione delle cellule ZR75-1 (Figura 4).
I comportamenti migratori dei due tipi cellulari erano differenti e possono essere confrontati sulla base delle immagini registrate. Lamellipodi (sporgenze blebbing) sono stati osservati in cellule MDA-MB-231 nella parte anteriore di migrazione all'inizio della migrazione, che era un segno tipico di riarrangiamento del citoscheletro, dirigendo il movimento delle cellule verso la regione senza cellula10 (Figura 5 ). Cellule di ZR75-1 ha mostrate alcun segno di migrazione cellulare allo stesso tempo-punto (Figura 5).
La densità relativa metrica di ferita è raccomandata dal fabbricante per l'invasione delle cellule, come è un'analisi di 3D e analisi basate su confluenza non sono applicabile. All'interno 50 h, la densità relativa ferita delle cellule MDA-MB-231 era saturo (100%), mentre la densità relativa ferita delle cellule ZR75-1 non è cambiato nel corso del tempo, che indica il fenotipo altamente invasivo delle cellule MDA-MB-231 e la non invasività delle celle (ZR75-1 Figura 6).
Cellule MDA-MB-231 anche si sono comportati in modo diverso durante l'invasione attraverso gel ECM (Figura 7). Rispetto alle cellule di vescichetta nella parte anteriore di migrazione, invadendo le cellule hanno mostrato una morfologia allungata con sporgenze leader.
Figura 1 : Flusso di lavoro di analisi di migrazione e invasione nel protocollo corrente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Prestazioni dello strumento gratta e Vinci su cellule di cancro al seno linee ZR75-1 e MDA-MB-231 (pannello superiore) con la ferita iniziale misurato larghezza e la confluenza della ferita iniziale (pannello inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di migrazione illustrata da immagini HD di contrasto di fase e modalità blended con maschere in MDA-MB-231. Blu, zero ferita; gialle, cellule che circondano il graffio della ferita; rosa, cellule che trasferirono il graffio ferita a 24 h dopo zero. Scala bar = 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Confronto di tre algoritmi (larghezza della ferita, densità relativa ferita e ferita confluenza delle linee cellulari di cancro al seno ZR75-1 (a sinistra) e MDA-MB-231 (a destra). Tutti gli esperimenti rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti, ± le barre di scala S.D. = 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Anteriore di migrazione di ZR75-1 e MDA-MB-231 cellule 4 h dopo zero. Frecce, lamellipodi nella parte anteriore di migrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Quantificazione dell'invasione utilizzando metriche densità relativa ferita (%) della linea cellulare di cancro al seno ZR75-1 (a sinistra) e MDA-MB-231 (a destra). Tutti gli esperimenti rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti, ± il S.D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Diverse caratteristiche cellulari delle cellule MDA-MB-231 in migrazione (a sinistra) e l'invasione (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : Un esempio di un graffio ferito che non può essere analizzato mediante il modulo di migrazione integrata da una piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrazione e invasione sono parametri importanti per valutare la mobilità delle cellule tumorali. Utilizzando lo strumento di gratta e Vinci di 96-pin, è possibile condurre la cicatrizzazione in saggi in 2D e 3D simultaneamente. Oltre a facilitare la scansione automatica, fornendo un ambiente di cultura cellulare stabile con il minimo disturbo, il dosaggio di gratta e Vinci condotto utilizzando il tool di gratta e Vinci di 96-pin fornisce costanti ferite gratta e Vinci, consentendo esperimenti che sono più robusti e riproducibile. Il formato di piastra a 96 pozzetti offre opzioni aggiuntive di entrambi aumentando il numero di linee cellulari o trattamenti farmacologici diversi. Inoltre, cambiamenti di morfologia delle cellule e movimento dinamico possono essere registrate per ulteriori analisi.
L'analisi di migrazione/invasione è progettato per essere facilmente applicabili con alcuni prerequisiti. Un monostrato di cellule confluenti è fondamentale prima del ferimento per garantire un movimento cellulare diretto verso il divario. Pertanto si consiglia vivamente di ottimizzare la densità di semina cellulare, e un intervallo di tempo tra 6-18 h è in genere ideale. La capacità delle cellule sperimentale allegare alla superficie e il tasso di proliferazione influirà questo lasso di tempo. Prolungata incubazione tempo potrebbe portare ad adesione cellula-cellula forte e generare fronti storti bilaterale delle cellule a causa della rimozione di strati delle cellule. Un rivestimento biomatrice sarà disponibile con meno linee cellulari adesivo, per diminuire i tempi di attesa. Le cellule possono essere affamate prima ferendo. Temporizzazione di inedia è simile a graffiare il timing, ovvero quando la confluenza raggiunge quasi il 100%, e l'inedia media e durata sono tipo di cella dipendente. Le cellule possono anche essere transfected, ma la densità di semina deve essere determinato per un tempo prolungato prima di ferire, considerando il tempo di incubazione del processo di trasfezione. Ferendo può essere raggiunto in pochi secondi utilizzando il tool di gratta e Vinci di 96-pin. Perni di dimensioni definite garantiscono una linea di partenza preciso migrazione/invasione e distanza. D'importanza, le sezioni superiore e inferiore devono essere ben allineate per completare un graffio completo attraverso i pozzi, in modo che le immagini di cellule vive non includono entrambi i terminal delle ferite gratta e Vinci. Le ferite di gratta e Vinci possono essere facilmente osservate attraverso occhi nudi su strato monomolecolare della cellula confluenti e possono essere rapidamente verificate sotto un microscopio a campo chiaro. Lavaggio dei pozzetti deve essere eseguita immediatamente e delicatamente per evitare reattachment di sloggiato le cellule e la rimozione delle cellule bilaterale. Se un lavaggio è sufficiente per ripulire la zona desiderata senza cellula, non esiste alcuna necessità di un ulteriore lavaggio.
Saggi di migrazione possono essere completati con l'aggiunta di terreni di coltura con o senza trattamenti e sono pronti per la scansione, mentre alcuni passaggi aggiuntivi sono necessari per essere presi in considerazione per l'analisi di un'invasione. A differenza di migrazione delle cellule, le cellule d'invasione penetrano attraverso ECM, che riflette più da vicino in vivo movimento cellulare migliore. L'entità dell'attuale protocollo è quello di generare un ambiente circondato da ECM utilizzando gel di ECM. Cellule sono seminate su pozzi di finitura gel-ECM e dopo la ferita, gel di ECM è a strati le cellule e la ferita di gratta e Vinci. Quando si maneggia gel di ECM, è meglio tenere tutto freddo per evitare la gelificazione. Disomogenea ECM gel può causare problemi quando messa a fuoco il microscopio. A causa della natura viscosa del gel di ECM, è possibile generare bolle, ma le bolle possono essere facilmente rimossi aspirando etanolo al 70% attraverso una bottiglia a spruzzo. Per generare spruzzo bene ma non eccessivo, basta svitare il tappo del flacone spray e spruzzare fuori l'etanolo al 70% in eccesso all'interno della paglia che punta altrove. Spruzzando a distanza sopra e orizzontale alla piastra, il getto di etanolo 70% fine è sufficiente per eliminare le bolle.
La prima scansione deve iniziare appena possibile dopo il ferimento, per acquisire l'area ferita senza cellula iniziale, e questo è importante per stabilire i criteri per l'analisi. Gli intervalli di scansione dipendono dal tipo di cella, come altre linee cellulari invasive hanno un ritmo più rapido di chiusura della ferita.
Questa applicazione di migrazione/invasione è relativamente semplice, e utilizzando il modulo built-in analisi, il movimento cellulare può essere graphed cineticamente con 3 parametri: la larghezza della ferita, confluenza della ferita e la densità relativa ferita (Figura 3). Tutti e tre possono essere utilizzati per valutare la migrazione. Larghezza della ferita descrive la distanza media in µm quando i fogli di cella bilaterale sposta relativamente parallelo ed è indipendente del limite della ferita iniziale. Confluenza di ferita e densità relativa ferita, al contrario, richiedono il limite iniziale della ferita nel calcolo e descrivono la confluenza all'interno dell'area della ferita e la densità delle cellule rispetto all'area di umiliazioni, rispettivamente. Per il dosaggio di invasione, densità relativa ferita è consigliato, poiché consente di calcolare l'area ferita in riferimento i fogli bilaterale delle cellule. I lettori potranno scegliere quello che meglio rappresenta le loro esigenze.
Questo test di migrazione/invasione di gratta e Vinci della ferita può essere conveniente, ma richiede lo strumento di gratta e Vinci di 96-pin, piastre designati e l'imager di cellule vive con il modulo integrato di migrazione/invasione di riprodurre i risultati tipici presentati nel presente protocollo, e Questi possono essere costosi. Sostituzioni conveniente come un fondo piatto piastra multipozzetto 96 pozzetti possono essere utilizzate e possono generare decente ai graffi ferite (dati non mostrati). Tuttavia, le prestazioni dello strumento gratta e Vinci non era buono come quando la piastra designata è stata utilizzata, e alcune ferite potrebbero non essere prelevate dalla modalità di scansione (Figura 8), così in grado di definire correttamente la zona ferita iniziale. Inoltre, il gratta e Vinci strumento utilizzabile per creare ferite gratta e Vinci, con analisi manualmente, tramite programmi di elaborazione di immagine, o utilizzando altri strumenti di visualizzazione e l'analisi di punto finale. Essi forniscono più flessibilità per individuare le ferite iniziale e pertanto non sono limitati alle piastre designate. D'altra parte, l'analisi di migrazione/invasione combinata con formazione immagine di cellule vive nel protocollo attuale è meno lunga e meno soggetta a errore. Questo potrebbe essere particolarmente utile per maggiore efficienza e coerenza sperimentale.
In conclusione, questa analisi di migrazione/invasione è veloce, facile e affidabile. Gli utenti possono scegliere dal nostro protocollo e altri in base alle loro necessità e al budget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i nostri finanziamenti a sostegno della Fondazione del gruppo di Bloomfield attraverso l'Istituto di ricerca medica Hunter (HMRI 13-02). X.Z è supportato da una borsa di studio di APA attraverso l'Università di Newcastle e HCRA biomarcatori Flagship PhD Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx (2012).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y.
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
