Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av sebrafisk Lens nucleus lokalisering og Sutural integritet

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Disse protokollene ble utviklet for å analysere kortikale linse morfologi, strukturelle integriteten til sebrafisk linsen sting i faste og levende linser og for å måle plasseringen av sebrafisk linsen kjernen langs fremre-bakre akse.

Abstract

Sebrafisk er unikt egnet for genetisk manipulering og in vivo Imaging, noe som gjør den til en stadig mer populær modell for omvendte genetiske studier og for generering av transgenics for in vivo Imaging. Disse unike evnene gjør sebrafisk til en ideell plattform for utvikling og fysiologi av øyelinsen. Våre nylige funn at en Aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabilitet av fremre linse Sutur, samt for forskyvning av linsen kjernen til linsen sentrum med alderen førte oss til å utvikle verktøy spesielt egnet til å analysere egenskapene til sebrafisk linser. Her har vi skissere detaljerte metoder for linse disseksjon som kan brukes til både larvestadiet og voksen linser, for å forberede dem for histologiske analyse, immunhistokjemi og Imaging. Vi fokuserer på analyse av objektiv Sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligner data generert fra dissekert linser med data innhentet fra in vivo Imaging av linse morfologi gjort mulig av en roman transgene sebrafisk linje med en genetisk kodet fluorescerende markør. Analyse av dissekert linser vinkelrett på deres optiske aksen tillater kvantifisering av den relative plasseringen av linsen kjernen langs fremre-bakre akse. Bevegelse av linsen kjernen fra en første fremre posisjon til sentrum er nødvendig for normal linseoptikk i voksen sebrafisk. Således, en kvantitativ mål av linsen atomer holdning direkte samsvarer med dens optisk eiendom.

Introduction

Den sebrafisk er en utmerket modell for å studere linsen utvikling og fysiologi på grunn av anatomiske likheter til pattedyr linser, relativ enkel genetisk og farmakologisk manipulasjon, hastighet av embryonale øyet utvikling, liten størrelse og åpenhet på tidlige stadier, noe som åpner for in vivo Imaging. Metodene som er beskrevet her ble utviklet for å analysere sebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på sutural integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og plassering av linsen kjernefysiske posisjon langs fremre-bakre akse ex vivo. Disse metodene fungerer som et utgangspunkt for funksjonelle studier av linse utvikling og fysiologi, samt omvendt genetiske skjermer for objektiv fenotyper i sebrafisk.

Imaging sebrafisk linse morfologi

Aquaporin 0 (AQP0) er den mest tallrike linse membran protein og er avgjørende for både objektiv utvikling og klarhet, på grunn av flere viktige funksjoner i pattedyr. Sebrafisk har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b) og vi har utviklet metoder for å analysere tap av sine funksjoner i både embryonale og voksne linser. Våre studier viser at aqp0a-/-mutanter utvikler fremre Polar dekkevne på grunn av ustabilitet i fremre Sutur, og aqp0a/b dobbel mutanter utvikle kjernefysisk gjennomsiktighet1. AQP0 har vist å spille roller i vann transport2, vedheft3,4, cytoskjelettkomponenter forankring5 og generering av brytningsindeksen gradient6, men disse studiene har i stor grad blitt utført i for å Sebrafisk gir en unik mulighet til å studere hvordan tap av funksjon, eller perturbed funksjon av Aqp0a eller Aqp0b vil påvirke morfologi og funksjon i en levende linse. For å vurdere objektiv celle morfologi og sutural integritet under utvikling, endret vi eksisterende in vitro immunhistokjemiske metoder7 for bruk i embryonale og voksne linser, og genererte transgenics for å overvåke denne prosessen in vivo .

Immunhistokjemiske analyse av plasma membran struktur og sutural integritet ble utført i hele faste embryo og voksen linser. Sebrafisk linser er svært små (linse diameter er ~ 100 μm i embryo og opp til 1 mm i voksne) sammenlignet med sine pattedyr kolleger og har punkt sting8, som sjelden fanges i cryosections. Dermed hele linser er avgjørende for å analysere sutural integritet. For in vivo analyse av fremre Sutur formasjon, og bilde av presis linse celle arkitektur, genererte vi Transgenics uttrykke mApple spesielt merking linse membraner.

Fordeler med live Imaging av linse membran transgenics inkluderer: 1) unngå fiksering gjenstander, 2) studere dynamiske morfologiske endringer i time-lapse filmer, og 3) muliggjør langsgående studier der tidligere hendelser kan være korrelert med senere fenotyper. Pigmentering av Iris hindrer normalt klar bilde av linsen periferi. Tillegg av 1-fenyl 2-thiourea (PTU) før Primordia-5 (prim-5) trinn9 forhindrer melanogenese og øye pigmentering opptil rundt 4 dager postfertilization (DPF). Men etter 4 DPF, linsen periferien er skjult i vivo, spesielt på eldre stadier. Videre tettheten av linsen selv tilslører bilde av sin bakre pol. Derfor, for å studere morfologi av linsen periferi, eller bakre Sutur, etter 4 DPF, linser må excised og fast.

Transgene sebrafisk-linjer har blitt brukt til å analysere embryonale linse membran strukturen i vivo10. Q01 transgene uttrykker en cyan fluorescerende protein smeltet til en membran rettet sekvens, Gap43, drevet av EF1α promoter og en heksamer av DF4 pax6 Enhancer element overalt i linse fiber celler11. Q01 har ekstra linse uttrykk, inkludert amacrine celler i Retina, som legger til bakgrunns signal hvis den primære interessen er objektivet. Vi utviklet en roman transgene line som uttrykker en membran-bundet mApple spesielt i objektivet, med sikte på å unngå eventuelle ekstra linse signal.

Lokalisering av linse kjerne

Vi oppdaget at linsen kjernen beveger seg fra en første fremre plassering i larvestadiet sebrafisk til et sentralt sted i fremre-bakre aksen i voksen linser. Dette skiftet i plasseringen av høy brytningsindeks linsen kjernen antas å være et krav for normal utvikling av sebrafisk linseoptikk1. Våre metoder tillater kvantifisering av objektiv kjernefysisk sentralisering i forhold til linsen radius. Ved hjelp av denne metoden, viste vi at Aqp0a er nødvendig for objektiv kjernefysisk sentralisering1, og denne enkle metoden kan brukes til andre studier av utvikling og fysiologi av linsen og dens optiske egenskaper i sebrafisk modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyret protokollene som brukes i denne studien holder seg til ARVO statement for bruk av dyr i øye og Vision forskning og har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av University of California, Irvine.

1. sebrafisk og døds-

  1. Heve og vedlikeholde sebrafisk (AB-belastning) under standard laboratorieforhold12. Raise embryo i embryo medium (EM)12. Legg 0,003% PTU til EM fra 20-24 h postfertilization (før prim-5 scenen) for å hindre pigment dannelse i embryo12 brukes til Imaging ved embryonale etapper9. Hev larver fra 6-30 dager postfertilization (DPF) på en diett av levende rotatorier inntil 14 DPF, og leve Artemia etter 14 DPF12.
    Forsiktig: PTU er svært giftig
  2. Bedøve fisken benytter tricaine til ingen-forståelsesfull å berøring.
    1. Forbered tricaine lager ved å kombinere 400 mg 3-amino benzosyre acidethylester, med 2,1 mL 1 M Tris (pH 9), i 100 mL ddH2O. Juster til pH 7,0 og oppbevares ved-20 ° c.
      Forsiktig: Tricaine er giftig.
    2. Fortynne 4,2 mL av tricaine lager inne 100 mL av tank vann å bedøve larver/voksen eller inne EM å bedøve embryo (Final konsentrasjonen av tricaine for 0,0165% w/v).

2. fiksering av embryo og larver

Merk: Immunhistokjemiske protokoller ble tilpasset fra tidligere publiserte materialer7.

  1. Fix dechorionated embryo eller larver opptil 2 uker postfertilization i 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA) i fosfat bufret saltvann (PBS) over natten ved 4 ° c på en rocker.
    Forsiktig: PFA er brennbart og er kreftfremkallende.
  2. Vask embryo tre ganger i 10 min i PBS, og permeabilize i PBS med 10% Triton og 1% DMSO (PBS-T) over natten ved 4 ° c.
    Forsiktig: DMSO er giftig, er skadelig ved svelging eller hud absorpsjon, bærer farlige stoffer gjennom huden, og er brennbart. Triton er giftig, etsende og er farlig for vann miljøer.

3. Disseksjon av larvestadiet og Adult sebrafisk objektiver

  1. Bedøve fisk fra 6 DPF larver til voksen med tricaine inntil ikke-responsive å berøre, men fortsatt viser en sterk hjerterytme. Mål fiske standard lengde som per Schilling (2002) for staging13.
  2. Umiddelbart avgiftsdirektoratet øyne ved hjelp av mikro-disseksjon saks og plass i en disseksjon parabolen i PBS (figur 2 vist for voksne øyne).
    1. Lag en egendefinert 35 mm rett fylt med silikon for objektiv dissections. Når silikon har satt, forbruksavgift en Divot rundt 2-3 mm i diameter og 0,5 mm dyp for immobilizing voksne øyne/linser under disseksjon.
  3. Disseksjon av voksne sebrafisk linser
    1. Plasser en voksen øye i parabolen Divot bakre side opp fylt med PBS. Nakkens øyet ved å sette inn pinsett ved < 45 ° vinkel gjennom den optiske platen. Vær forsiktig så du ikke Nick eller komprimere linsen. Lag to eller tre radial snitt gjennom Retina og sclera fra den optiske platen til ciliary sonen med disseksjon saks.
    2. Vipp netthinnen og sclera som blomst kronblad og invertere øyet, hornhinnen side opp. Nakkens objektivet indirekte via manipulering av sclera og hornhinnen med den flate siden av saksen, mens trekke bort Retina og festet vev med tang. Nøye trim overflødig vev fra linsen.
      Merk: Det er viktig å analysere nøye for å oppnå konsekvent sunne linser.
  4. Disseksjon av larvestadiet sebrafisk linser
    1. Plasser en larvestadiet øye bakre side opp på den flate delen av silikon parabolen fylt med PBS og bruke en skjerpet tungsten nål for å gjøre radial kutt gjennom Retina og sclera mens immobilizing øyet med en annen tungsten nål eller tang.
      Merk: Vær forsiktig så du ikke skader linsen.
      1. Skjerpe tuppen av en 2 cm lengde på 0,1 mm tungsten wire elektrolytisk ved å suspendere wire spissen i 10% (w/v) NaOH og bruke en lav spenning vekslende-gjeldende14. Fest nålen inn i en Pasteur-pipette ved å smelte glass enden med en Bunsen-brenner.
        Merk: Alternative fine disseksjon verktøy kan også brukes.
        Forsiktig: NaOH er etsende.
    2. Forsiktig scoop ut linsen fra dissosiert øyet med en butt side av nålen, og forsiktig trekke bort festet vev.

4. fiksering av dissekert linser

  1. Umiddelbart fikse dissekert linser i 1,5% (v/v) PFA i PBS for 24 timer ved romtemperatur (RT). Vask linser tre ganger i PBS for 10 min hver.
  2. Permeabilize linser for hele monterings analyser eller cryoprotect for kryosnitt (se pkt. 8).
    1. Permeabilize linser i PBS-T over natten ved 4 ° c.

5. Lens immunhistokjemi

  1. Etikett membraner for faste embryo-larvestadiet eller voksen linser av inkubasjons i Phalloidin-Alexa fluor 546 (1:200) og cellekjerner med DAPI (1:1000 av 5 mg/ml lager) i PBS-T over natten ved 4 ° c.
    Forsiktig: DAPI er en hud og øye irriterende.
  2. Vask tre ganger med PBS-T for 10 min hver. Tøm vev ved inkubasjons i 30%, 50% og 70% glyserol i PBS-T (v/v) i minst 1 time ved RT hver, eller over natten ved 4 ° c.
  3. Mount fisk i 70% glyserol i PBS-T (v/v) på glass bunnen 35 mm mikrotiterplateleser retter med øyne som flatt og rett mot dekselet slip som mulig. For yngre fisk, kan en svak fremre-lateral vippe bidra til å orientere linsen Sutur å være parallelt med dekkglass.

6. analyse av sebrafisk fremre linse sting ved hjelp av en transgene line in vivo

  1. Generer TG (βB1cry: mAppleCAAX)- linjer ved hjelp av Tol2 Kit15. Den Tol2 transposable element system15 muliggjør stabil integrering av konstruksjonen der mApple er drevet av 300 BP av den menneskelige βB1-crystallin arrangøren16 bundet til membranen av CAAX sekvensen resulterer i uttrykket spesielt i linse fiber cellemembraner.
    Merk: Denne konstruksjonen (ID: 122451) er tilgjengelig for kjøp.
    1. På morgenen av injeksjon, forberede injeksjon blandingen og holde på isen. For å nå et endelig volum på 10 μL av inneholdende RNase-og DNase-Free H2O, tilsett: 1,5 μL av HuΒB1cry: mAppleCAAX DNA-konstruere ved 50 ng/μL-[0.375-0,75 PG/endelig injeksjon], 1,5 ΜL av Tol2 transposase mRNA ved 300 ng/μL (Tol2 sett)15 [15-30 PG/ endelig injeksjon], og 1 μL av fenol rød indikator på 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/Final injeksjon].
    2. Injiser 50-100 en injeksjon i 1-celle embryo12.
  2. Mål transgenesis effektivitet i F0 injisert embryo ved å måle frekvensen av embryo med mApple positive linser på 3 DPF.
    Merk: Forvent å ha > 80% transgenesis effektivitet ved hjelp av denne metoden. F0 mosaikk tillate detaljert analyse av membran morfologier av individuelle celler. Varierende nivåer av mosaikk gjør det mulig å avbilde morfologier av enkle eller små grupper av celler, mens mer globalt linse uttrykk tillater analyse av flercellede strukturer som linse sting in vivo.
  3. Parre ut F0 mosaikk fisk å generere stabile linjer, som etiketten alle fiber cellemembraner. F0 grunnleggere med transgene integrert i germline vil generere avkom med stabile integrasjoner som kan opprettholdes som transgene linjer.

7. analyse av sebrafisk fremre linse sting ved hjelp av en transgene line in vivo

  1. Bedøve 3 DPF eller voksen mosaikk eller stabil transgene fisk og montere i 1% lav smelte agarose (LMA) med tricaine med øyet flatt mot dekselet slip av glass Bottom mikrotiterplateleser retter.
    1. Oppløse 1 g av LMA i 100 mL av EM (uten metylen blå) for å gjøre 1% LMA. Lagre lang sikt som 15 mL lager ved 4 ° c. Mikrobølgeovn for å oppløse lager og lagre ved 42 ° c til hvert rør er brukt.
  2. Dekk fisk opp til 6 DPF med EM med tricaine, eller med tank vann med tricaine for voksne når LMA er satt.
    1. Bland 5 mL EM uten metylen blått eller tank vann med 250 μL av tricaine lager og 7 μL av PTU hvis bildebehandling PTU behandlet fisk.

8. Lens kryosnitt og immunhistokjemi

  1. Cryoprotect faste embryo eller voksen linser ved å plassere i 10% sukrose i PBS (w/v), 20% sukrose for 1 time ved RT hver (eller over natten ved 4 ° c) og overnatting i 30% sukrose ved 4 ° c.
  2. Embed vev i OCT i basen muggsopp, og deretter fryse på Chucks med OCT. Cryosection på 12-14 μm og samle på en Superfrost/Plus mikroskop lysbilder. Varm seksjoner på lysbildet i 10 min på en lysbilde varmere prewarmed til ~ 35 ° c.
  3. Vask seksjoner tre ganger med PBS for 10 min hver. Label seksjoner med Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) med DAPI (1:1000) eller WGA-Alexa Flour 594 (1:200), etterfulgt av tre PBS vasker. Monter med anti-fade festemiddel, og forsegle dekkglass med neglelakk.

9. bildebehandling

  1. Skaff bilder med et konfokalmikroskopi mikroskop. Anskaffe z-stabler eller optiske skiver ved hjelp av en 60x N/A 1,2 vann-nedsenking mål, eller lignende, på bestemte regioner fra fremre til bakre linse pol. Bruk følgende anskaffelses innstillinger: 1,2 luftig plate med 561 NM laser, Texas rødt filter for phalloidin-Alexa Flour 546 eller mApple, eller den 405 laseren med UV-filter for DAPI.
  2. Korriger z-intensitet laser kraft for å motvirke signaltap med dybde inn i linsen. Dette gir et sterkt signal på bakre pol av faste og levende 3 DPF embryo, og sterkt signal i Ekvatorial optiske skiver i voksen fisk linser.
  3. Kompilere og vise bilder ved hjelp av bildebehandling programvare.

10. måling av Lens nucleus lokalisering i fremre-bakre aksen

  1. Orient ferske excised linser aksialt i PBS i en 35 mm rett med en dekkglass bunn, med stolper og sting orientert parallelt med flyet av fokus. Se etter en forskjell i brytningsindeksen, som vanligvis forekommer i grensesnittet til linse barken og linse kjernen for å identifisere linse kjernen.
    Merk: Sunn vill type voksen linser er ekstremt gjennomsiktig gjør det vanskelig å se linsen sting og kjerne, eller å bestemme linsen orientering. I dette tilfellet, en liten Nick med tang til linsen kapselen forårsaker mindre skader, noe som gjør sting og linse kjernen tilsynelatende i ca 10 min bidrar til å orientere linsen for denne målingen. Men linsene blir ubrukelig for nedstrøms programmer som de er nå skadet.
  2. Ta bilder av linser med linsen kjernen i fokus under lyse feltet belysning med eller uten DIC optikk ved hjelp av en disseksjon mikroskop med et kamera vedlagt. Bilde en mikrometer under samme forstørrelse for kalibrering.
    1. Klikk på Live View-knappen, justere eksponerings innstillingene for å visualisere linse kjernen og linsen periferi, og ta et bilde ved å klikke på snap shot-knappen. Lagre som en TIF-fil.
    2. Bruk bildebehandlingsprogram for å kalibrere de oppnådde linse bildene. Velg det lineære verktøyet og tegn en linje med kjent lengde på det mikrometer bildet, klikk analyser | angitt skala. Angi kjent avstand, enheter og velg ' Global ' kalibrering, og klikk OK.
  3. Mål avstanden til midten av linsen kjernen til fremre Pol (a-r).
    1. Bruk den lineære verktøyet i bildebehandling programvare for å tegne en linje over avbildet midten av linsen kjernen i en aksial orientering. Ta sentrum av denne linjen som sentrum av linsen kjernen.
    2. Tegn en annen linje fra dette punktet til fremre pol av objektivet og velg "måle" i "analyser"-menyen for å måle avstanden (a-r), hvor a er radius av linsen og r er avstanden fra midten av linsen til midten av den Kjernen.
    3. Tegn en annen linje fra fremre til bakre polene og måle denne avstanden som linsen diameter (2a). Kopier disse lengdene fra resultatvinduet, og Overfør til et regneark-eller statistikk program.
      Merk: Det er lettere å presist måle fra sentrum av kjernen til fremre Pol, enn å måle fra midten av linsen kjernen til midten av linsen. Denne målingen konverteres av formelen i trinn 10.3.5 for å rapportere avstanden til midten av linse kjernen til midten av linsen. Bruk alltid den voksne kjernen for målinger, selv om den embryonale kjernen er tydelig.
    4. Del diameteren med 2, for å beregne linsen radius, a.
    5. Beregn r/a, som Equation 1 , som er normalisert lokalisering av linsen kjernen med hensyn til linsen radius.
      Merk: for en kjerne plassert nærmere den fremre stangen, vil r/a være > 0,0, mens en sentralt lokalisert kjerne vil ha en r/a av 0,0.
  4. Graph loggen av normalisert aksial kjernen måling som en funksjon av standard lengde for å bestemme endringer i linse kjernen lokalisering under sebrafisk utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voksen sebrafisk øye anatomi ligner det av pattedyr (figur 1a). Til tross for noen forskjeller mellom sebrafisk og pattedyr øyne, slik som å ha en ciliary sone i stedet for en ciliary kropp17, forskjeller i optiske egenskaper18, og forskjeller i morphogenesis under embryonale utviklingen19, den sebrafisk Eye er en utmerket modell for å studere øye utvikling og forstå øyensykdom20,21,22. En enkel epitel linjer den fremre pol av linsen, som ved ekvator gjennomgår en livslang prosess med spredning, forlengelse, og differensiering inn i fiber celler, utgjør mesteparten av linsen. Modne fiber celler (figur 1B, lys blå) først differensiere i fosteret, er blottet for organeller og blir aldri erstattet. Skille fiber celle tips møtes ved polene for å danne den fremre og bakre sting. Disse cellene blir deretter internalisert av nylig differensiert fiber celler. Som Alle virveldyr linser, har sebrafisk linsen dermed en gradient av utvikling med de eldste cellene ligger i sentrum av linsen kjernen. Den sebrafisk linse placode danner ved 16 h postfertilization (hpf), som elongates å danne den primære linse fibrene ved 18 hpf, og sekundære fibre danner overgangen sonen på 28-36 hpf. Den bakre Sutur er synlig på 48 hpf, som er før den fremre Sutur blir synlig10.

Den presise utvikling og vedlikehold av vanlig linse arkitektur er avgjørende for sin optikk. Her beskriver vi metoder for analyse av sebrafisk linse celle morfologi in vitro og in vivo, inkludert både fordeler og begrensninger, som vi utviklet for å analysere fenotyper som følge av tap av funksjon mutanter av to sebrafisk Aqp0s, Aqp0a og Aqp0b1. For vurdering av voksen linse morfologi in vitro, linser ble dissekert (figur 2) og umiddelbart fast. Embryonale vurderingen ble utført i hele faste embryo (Figur 3) og sammenlignet med levende transgene embryo (Figur 4). Dissekert og faste voksen linser (figur 5) ble sammenlignet med transgene voksen linser avbildet Live (figur 6). Forskjeller i deteksjon og visualisering av bestemte deler av objektivet ved hjelp av disse metodene er oppsummert (tabell 1).

Phalloidin ble funnet å være overlegen for merking linse fiber cellemembraner i sebrafisk sammenlignet med hvete bakterie agglutinin (WGA). WGA er en Lektiner det binder å N-acetyl-D-Glucosamine og Sialic syren, og WGA bøyd å fluorophores er karakteristisk pleide avmerke linsen fiber cellen membraner inne human23, storfe24, sau25, musen26, rotten27 og sebrafisk28,29. Her bruker vi phalloidin på hele sebrafisk linser (Figur 3, figur 5).

Embryonale og larvestadiet sebrafisk larver opp til 7 DPF er små og gjennomtrengelig nok til å tillate inntrengning av phalloidin inn i linsen ytre cortex. Ved 3 DPF linsen kjernen er kompakt og blottet for organeller, fremre sting form på fremre Pol (figur 3a,B), og phalloidin er utelukket fra linsen kjernen i en Ekvatorial optisk plan (figur 3c,D). Phalloidin er sannsynlig utelukket fra kjernen på grunn av høy komprimering av fiber cellemembraner, i samsvar med tidligere studier28. Men den ytre cortex er i stor detalj med denne farging (figur 3c-F). I tverrsnitt, fiber celler ta på en flat Sekskantet form, med lengre brede sider, og kortere smale sider. Phalloidin sterkt etikettene både smale og brede fiber cellemembraner (figur 3e-F) fremhever komprimering av kortikale fiber celler mellom brede sider. Denne organisasjonen er i stor grad upåvirket av aqp0a/b Double mutanter (figur 3b, D, F og H).

Mosaic uttrykk for transgene (mApple bundet til cellemembranen av CAAX motiv drevet av en 300 BP promoter regionen av den menneskelige βB1 crystallin promoter) sterkt uttrykker i linser som begynner på 2 DPF. Det transgene er tilfeldig integrert inn i Genova resulterer inne heterogene gjengivelsen av mApple. Vi viser eksempler på en 3 DPF linse med sterkt uttrykk i cortex (Figur 4) og uttrykk i deler av kjernen (figur 4d). Membranen markøren er ikke begrenset av permeabilitet som phalloidin, og dermed merker linsen kjernen. Mosaikk (Figur 4) generert av DNA-injeksjoner som bare uttrykkes i en liten undergruppe av celler er nyttige for å analysere individuelle celle morfologier sammenlignet med stabile linjer, som etiketten hver celle som uttrykker βB1 Crystallin (figur 6). I TG (βB1cry: mAppleCAAX) mosaikk morfologi av de fremre Sutur kan bli visualisere i z-anslag tatt på fremre Pol (figur 4a,B). Merk at morfologi av cellemembraner skiller seg fra faste linser merket med phalloidin (figur 3a,B), og tilstedeværelsen av underdomener i brede cellemembraner (figur 4a' hvite piler) tidligere identifisert i linser fra andre arter30 er synlig. Men svakere merking av smale fiber cellemembraner resulterer i en manglende evne til å se slående konvergens av celler ved fremre Sutur (figur 4a,B arrow) sett i faste linser merket med phalloidin (figur 3a,B piler).

Interessant, optiske skiver tatt på linsen ekvator også avdekke en annen merking mønster, med åpenbare forstyrrelser til celle volum i aqp0a/b doble mutanter SAMMENLIGNET med WT (figur 4c-F). Dette er sannsynligvis fordi transgene etikettene brede fiber cellemembraner mer effektivt enn phalloidin. Vi var i stand til å oppnå z-anslag gjennom bakre Pol for å analysere integriteten til bakre Sutur med bruk av Z-korreksjon, som økt laser effekt med dybde i vev. Klar analyse av bakre Sutur (figur 4G,H) i intakt fisken var begrenset til de første 5 DPF, og etter at objektivet var for tett, noe som resulterer i tap av signal i bakre del av linsen.

Fast dissekert voksen linser merket med phalloidin avdekket slående detaljer i den svært bestilte arkitekturen av fiber cellerader sammenfallende å danne fremre sting (figur 5a, pil) og morfologi av cortex (figur 5c-H), på grunn av meget sterk merking av smale fiber cellemembraner av phalloidin. Maksimum Z-anslag av fremre Pol avdekket tap av en stram fremre Sutur i aqp0a/b doble mutant linser (figur 5B, pil), sammenlignet med WT (figur 5a, arrow), som tydelig som en masse av membraner og cellekjerner i optiske skiver 30 μm fra fremre Pol (fig. 5D). I dypere optiske skiver, phalloidin merking ble ekskludert fra den dypere linsen cortex og nucleus (figur 5e,F). Den generelle organiseringen av fiber cellerader i ytre cortex var noe påvirket av mangel på en stram fremre Sutur i aqp0a/b doble mutant linser, noe som gjør det umulig å posisjonere linser nøyaktig vinkelrett på Imaging flyet (figur 5F ) sammenlignet med WT linser (figur 5e). Men høy effekt bilder av fiber cellerader tatt i ekvator flyet avslørte at cellene i den ytre cortex fortsatt dannet ryddig rader, synlig på grunn av sterk smal fiber cellemerking (figur 5G,H). Det var umulig å skjelne individuelle fiber celle brede membraner på grunn av en kombinasjon av deres stramme komprimering, og svakt signal. Siden disse linsene var dissekert, kunne de monteres med bakre side mot målet, slik at z-anslag av bakre sting, som viste ingen forskjeller mellom genotyper som bakre fiber celle tips dannet stramme sting (figur 5I,J -piler).

Z-anslag av linser av levende anesthetized voksen stabil TG (βB1cry: mAppleCAAX) fisk avslører kortikale membran morfologi i fremre cortex (figur 6a,a '), samt omfanget av celle konvergens ved fremre Pol ( Figur 6B). Det var vanskeligere å montere fisken med linse sting vinkelrett på Imaging flyet, sammenlignet med faste dissekert linser. Stabile linjer som frakter transgene uttrykker mApple i linse kjernen (figur 6C,D). Optiske skiver ved ekvator avdekket et sterkt signal som indikerer omfattende komprimering av kjernen når avbildet med samme laser kraft som fremre cortex (figur 6C). Interessant, ingen mobilnettet oppløsning av den ytre cortex var tydelig hos voksne, i motsetning til embryo. Dette skyldes sannsynligvis at Iris blokkerer et klart signal fra linsen periferi. Det kan være mulig å oppnå et sterkere objektiv kortikale signal ved utvidelse av eleven før bildebehandling. Med redusert laser kraft, var det mulig å skille noen celle lag i linsen kjernen (figur 6D). Den voksne sebrafisk linsen er svært tett, og det var umulig å få signal fra den bakre stangen in vivo.

Vi har vist at sebrafisk linsen kjernen beveger seg i den optiske aksen fra en innledende fremre posisjon i larvestadiet linser til en sentral posisjon i voksne1. Disse bevegelsene er uthevet i aksial linse seksjoner, som phalloidin og WGA er utelukket fra linsen kjernen (figur 7A-C). Vi har vist at Aqp0a er nødvendig for denne sentralisering prosessen1, men denne mekanismen vil trolig bli påvirket av andre proteiner. Lokalisering av sentrum av linsen kjernen i forhold til sin posisjon langs den fremre-bakre aksen ble målt ved å plassere dissekert hele linser i deres aksial orientering og Imaging under DIC belysning, og dermed fremheve små forskjeller i brytnings egenskaper (figur 7e). De sting har vanligvis en annen brytningsindeks enn den omkringliggende cortex, så kan brukes som en veiledning for orientering. Unge larvestadiet linser har mer åpenbare sting (bakre sting i svært små linser), og linse kjerner, som har en annen brytningsindeks, er åpenbart asymmetrisk, noe som gjør det enklere å orientere linser på disse stadiene. Den relative avstanden til midten av linsen kjernen fra midten av objektivet (r) er normalisert til linsen radius (a). Dette er da grafisk med forhold til sebrafisk utvikling, som standard lengdemåling brukes13. I WT starter linse kjernen nærmere fremre linse Pol Equation 2 , og deretter sentraliserer Equation 3 i voksen alder (figur 7F).

Figure 1
Figur 1 : Sebrafisk voksen øye og objektiv diagram. Fremre er tatt som hvor lyset kommer inn i øyet, som i sebrafisk er faktisk lateral. (A) sebrafisk linsen sammen med hornhinnen fokus lys på Retina. I akvatiske dyr, spiller hornhinnen en mindre rolle i lysbrytning, men i stedet, har linsen en høyere brytningsindeks18. Objektivet skiller fremre kammer fylt med vandig humor og bakre kammer fylt med glasslegemet humor. (B) sebrafisk linsen er mer sfærisk enn pattedyr linser. Fiber celle tips møtes på punkt eller navle sting8 på de fremre og bakre polene. Skille fiber celler i linsen cortex har kjerner og organeller, mens modne fiber celler i linsen kjernen (lyseblå) er blottet for organeller og kjerner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.    

Figure 2
Figur 2 : Sebrafisk linse disseksjon. (A) øyne er dissekert fra anesthetized fisk og plassert bakre side opp (B). (C) øyne er immobilisert av pinsett via den optiske platen (OD) og to til tre radial snitt er laget i Retina og sclera fra den optiske platen til zonules. (D) brett klaffene ut for å avdekke linsen. (E) Roter øyet til ansikt hornhinnen opp, nakkens objektivet indirekte via hornhinnen og dra bort sclera-Retina. (F) trim vekk gjenværende Retina-og ciliary sone/zonules fra objektivet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Embryonale linse morfologi in vitro. Fast og permeabilized embryo merket med phalloidin (rød) og cellekjerner med DAPI (blå) avslører membran morfologi og Sutur integritet ved polene. Z-anslag avslører at WT og aqp0/b dobbel mutant objektiver utstillingen svært vanlig fiber celle arrangement som møtes på en svært stram fremre Sutur (piler) på 3 DPF (a, b). Optiske skiver tatt ved ekvator avslører stramme rekker av sekskantede fiber celler pakket i den ytre cortex i begge genotyper (C-F). Både smale og brede sider av fiber cellemembraner er merket som vist i (E). Bakre sting (piler) dannes og tett i begge genotyper (G, H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Embryonale linse morfologi in vivo. Live Imaging av anesthetized 3 DPF mosaikk F0 injisert TG (βB1cry: mAppleCAAX) linser avslører fremre sting (piler) i z-anslag (A, B). (a ') Membran underdomener er tydelig som puncta (hvite piler) i brede fiber cellemembraner. Smale fiber cellemembraner er også tydelig (svarte piler). WT linser avslører tett pakket linse kortikale fiber celler (C, E), sammenlignet med forstyrret cortex på aqp0a/b dobbel mutanter- med åpenbare hovne celler (D, F). Fokus på bakre (g, h) sting (piler) avslører ingen forskjell mellom genotyper (G, H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Voksen linse morfologi in vitro. Excised, faste og permeabilized linser fra fisk over 23 mm standard lengde ble merket med phalloidin (rød) og DAPI (blå). 150 μm Z-projeksjon på fremre Pol avslører streng ordning av fiber celle tips sammenfallende på en stram Sutur (pil) i WT (a), men ikke aqp0a/b Double mutanter (pil), som i stedet har en masse av membraner og kjerner (b). En optisk skive tatt 42 μm fra fremre Pol avslører bestilte celler sammenfallende i sentrum i WT (C), men en masse av kjerner der Sutur skal være i mutant objektiver (D). Optiske skiver gjennom ekvator av linsen, på 130 μm fra fremre Pol avslører tett pakket rader av fiber celler i WT (E, G) og mutanter (F, H). Bakre sting (piler) dannes og tett i begge genotyper (I, J). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 Voksen linse morfologi in vivo. Live Imaging av anesthetized voksen stabil TG (βB1cry: mAppleCAAX) WT linser. Z-anslag på fremre cortex avslører kortikale morfologi (a, a '), og fremre Sutur (pil), med celler som sammenfallende til et punkt i en enkelt optisk skive (B, pil). Cortex kan bli visualisere ved høyere laser effekt i en optisk skive gjennom ekvator (C), sammenlignet med sterkere signal form linsen kjernen (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Sebrafisk linse nucleus sentralisering. Fast og cryoprotected embryo (A) og linser (B, C) var aksialt delt og merket med phalloidin-546 (rød i a, b), DAPI (blå i a, b) eller WGA-594 (rød i C). Linsen kjernen er blottet for cellekjerner, og er plassert nærmere den fremre (a) linse på 3 DPF (a), og i 1 måned gamle linser (B), sammenlignet med å være sentralt plassert i voksen linser (C). Dissekert linser fra en 1 måned gammel sebrafisk av 4,1 mm standard lengde var orientert equatorially (D), eller aksialt (E). Den relative lokalisering av linsen kjernen i aksen ble beregnet ved hjelp av følgende strategi: (E) avstanden til sentrum (*) av linsen kjernen (hvit stiplet linje) ble målt til fremre Pol, som dette mer praktisk enn å måle avstand (r) til midten av objektivet (pluss). Dette var normalisert til linsen radius (a), som ble innledningsvis målt som aksial (Ant.-POS.) linse diameter. Loggen av normalisert aksial kjernen lokalisering ble grafisk som en funksjon av sebrafisk utvikling, målt ved standard lengde (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Funksjonen IHC embryo Vs embryo Hele IHC voksen linse Vs voksen
Live N Y N Y
Fremre Sutur Y Noe Y Noe
Bakre Sutur Y Y Y N
Kortikale cellulære detaljer Noe Y Y Fremre noe
Objektiv nucleus detalj N Y (stabil) N Y (stabil)
Sekundær etikett Y-antistoffer Bare Live med bare TG Y-antistoffer Bare Live med bare TG
Bred/smal fiber etikett Både Bred Stort sett smale Bred

Tabell 1: Sammendrag av sammenligning av in vivo vs in vitro -metoder for analyse av objektiv morfologi i sebrafisk. Y = ja, N = nei

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse av sebrafisk linse morfologi er det første skrittet for å forstå fenotyper i mutanter, eller virkningene av farmakologiske intervensjoner som tar sikte på å studere biologi av øyelinsen. Vi skisserer metoder for å analysere linse sting, kortikale fiber celle morfologi og aspekter av linsen kjernen. Disse tilnærmingene er en kombinasjon av in vitro og in vivo (sammenlignet i tabell 1). In vitro metoder gir større detalj av den ytre kortikale celle morfologi, samt tilgang til bakre Sutur i voksen linser.

In vivo -analyse er mulig ved bruk av transgene markører. Den transgene vi introduserer her er objektiv membran spesifikk, sammenlignet med den eksisterende Q01 sebrafisk linje, som samtidig merking av linsen membraner også etiketter andre celletyper i øyet, inkludert amacrine celler, kompliserer tolkning11 . In vivo -signalet er begrenset av det pigmentert epitel i øyet, som dannes under den andre dagen av embryogenesis, så EMBRYO må PTU behandles for analyse på dette og senere stadier. Hos voksne, Iris tilslører klar analyse av linsen cortex, men tillater in vivo analyse av fremre linse cortex. Live Imaging av fisk linser gjør det mulig for langsgående studier av linsen morfologi i samme dyret. Dette kan være et svært nyttig verktøy for å studere effekter på dynamiske prosesser, for eksempel celle volum avbrudd som svar på osmotisk eller farmakologiske forstyrrelser. Et uventet funn er at vi kan tydelig visualisere membranen underdomener i brede fiber cellemembraner i live larvestadiet transgenics, men ikke i faste linser. Dette fremhever forskjellen i merking av transgene og phalloidin, samt det faktum at disse underdomenene kan bli påvirket av fikseringsprosessen.

Analyse av de molekylære mekanismer av linse kjernen sentralisering ved hjelp av metodene vi beskriver kan avdekke mekanismer avgjørende for utviklingen av linsen optiske egenskaper. Selv om, hittil, aksial linse nucleus asymmetri har bare blitt rapportert i sebrafisk, ved å studere denne prosessen er vi sannsynligvis til å få innsikt i mekanismer som kreves for utvikling av linseoptikk i andre arter. I fremtiden kan transgene dyrene brukes i kombinasjon med andre anvendelser-slik som overuttrykte studier, med bruk av en grønn transgenesis markør. Disse kan brukes til å studere effekter av overexpressing et bestemt protein i linsen, eller for redning av fenotyper i eksisterende mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Vi ønsker å erkjenne vår finansieringskilde: NIH R01 EY05661, Ines Gehring for å bistå med å generere aqp0a/b Double mutanter og sebrafisk husdyrhold, Dr Daniel Dranow for diskusjoner som fører til generering av Transgenics, Dr. Bruce Blumberg og Dr Ken Cho ' s Labs for bruk av deres dissekere mikroskop, og Dr. Megan Smith for hjelp med statistisk analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

Biologi sebrafisk linse linse Sutur linse kjernen AQP0 MIP Live Imaging linse utvikling transgene
Vurdering av sebrafisk Lens nucleus lokalisering og Sutural integritet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter