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Biology

Zebrafish लेंस नाभिक स्थानीयकरण और सांस्कृतिक अखंडता का मूल्यांकन

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

इन प्रोटोकॉल वल्कुट लेंस आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किए गए थे, zebrafish लेंस की संरचनात्मक अखंडता स्थिर और लाइव लेंस में टांके और अग्रवर्ती अक्ष के साथ zebrafish लेंस नाभिक की स्थिति को मापने के लिए ।

Abstract

Zebrafish विशिष्ट आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए और vivo इमेजिंग में अनुकूल है, यह रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक तेजी से लोकप्रिय मॉडल और vivo में इमेजिंग के लिए पराजीनी की पीढ़ी के लिए बना रही है । इन अद्वितीय क्षमताओं zebrafish एक आदर्श मंच नेत्र लेंस विकास और शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए बनाते हैं । हमारे हाल के निष्कर्षों कि एक Aquaporin-0, Aqp0a, पूर्वकाल लेंस सीवन की स्थिरता के लिए आवश्यक है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में उंर के साथ लेंस केंद्र को लेंस नाभिक के बदलाव के लिए हमें विशेष रूप से zebrafish लेंस के गुणों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल उपकरण विकसित करने के लिए नेतृत्व किया । यहां हम लेंस विच्छेदन कि दोनों लार्वा और वयस्क लेंस के लिए लागू किया जा सकता है के लिए विस्तृत तरीके रूपरेखा, उंहें ऊतकीय विश्लेषण के लिए तैयार, immunohistochemistry और इमेजिंग । हम लेंस सीवन अखंडता और वल्कुट कोशिका आकारिकी के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करने और लेंस के vivo इमेजिंग में से प्राप्त डेटा के साथ विच्छेदित लेंस से उत्पंन डेटा की तुलना एक उपंयास ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन के साथ एक आनुवंशिक रूप से संभव बनाया एनकोडेड फ्लोरोसेंट मार्कर । विच्छेदी लेंस का विश्लेषण उनके ऑप्टिकल अक्ष के लंबवत होता है, जो अग्रवर्ती अक्ष के साथ लेंस नाभिक की सापेक्ष स्थिति का परिमाणीकरण की अनुमति देता है । एक प्रारंभिक पूर्वकाल स्थिति से केंद्र के लेंस नाभिक के संचलन वयस्क zebrafish में सामान्य लेंस ऑप्टिक्स के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, लेंस की एक मात्रात्मक माप परमाणु स्थिति सीधे अपने ऑप्टिकल गुणों के साथ संबद्ध ।

Introduction

Zebrafish लेंस विकास और स्तनधारियों लेंस के लिए संरचनात्मक समानताएं, आनुवंशिक और औषधीय हेरफेर के सापेक्ष आसानी, भ्रूणीय नेत्र विकास, छोटे आकार और पारदर्शिता की गति के कारण अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है प्रारंभिक चरण में वीवो इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । यहां वर्णित तरीके भ्रूणीय और वयस्क चरणों में zebrafish लेंस आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किए गए sutural अखंडता पर ध्यान देने के साथ, वल्कुट में विट्रो में कला आकारिकी और vivo में, और लेंस के साथ परमाणु स्थिति के स्थान पूर्वकाल-पश्च अक्ष पूर्व vivo। इन तरीकों लेंस विकास और शरीर क्रिया विज्ञान के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा, साथ ही रिवर्स zebrafish में लेंस फीनोटाइप के लिए आनुवंशिक स्क्रीन ।

इमेजिंग zebrafish लेंस आकारिकी

Aquaporin 0 (AQP0) सबसे प्रचुर मात्रा में लेंस झिल्ली प्रोटीन है और दोनों के लिए महत्वपूर्ण है, लेंस विकास और स्पष्टता, स्तनधारियों में कई आवश्यक कार्यों के कारण । Zebrafish दो Aqp0s (Aqp0a और Aqp0b) है और हम दोनों भ्रूणीय और वयस्क लेंस में उनके कार्यों की हानि का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का विकास किया है । हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि aqp0a-/-म्यूटेंट पूर्वकाल सीवन की अस्थिरता के कारण पूर्वकाल ध्रुवीय अस्पष्टता का विकास, और aqp0a/ AQP0 जल परिवहन2, आसंजन3,4, साइरोस्केलेटल और5 अपवर्तक सूचकांक ढाल की पीढ़ी6में भूमिका निभा दिखाया गया है, लेकिन इन अध्ययनों में काफी हद तक प्रदर्शन किया गया है विट्रो। Zebrafish एक अनूठा अवसर प्रदान करता है कैसे समारोह की हानि, या Aqp0a या Aqp0b के क्षुब्ध समारोह एक जीवित लेंस में आकारिकी और समारोह को प्रभावित करेगा का अध्ययन । लेंस सेल आकृति विज्ञान और विकास के दौरान सुसांस्कृतिक अखंडता का आकलन करने के लिए, हम में मौजूदा संशोधित विट्रो immunohistochemical तरीकों7 भ्रूणीय और वयस्क लेंस में उपयोग के लिए, और पराजीनी उत्पंन करने के लिए vivo में इस प्रक्रिया की निगरानी .

प्लाज्मा झिल्ली संरचना और सुसांस्कृतिक अखंडता के immunohistochemical विश्लेषण पूरे फिक्स्ड भ्रूण और वयस्क लेंस में किया गया था । Zebrafish लेंस बहुत छोटे है (लेंस व्यास भ्रूण में ~ १०० μm है और वयस्कों में 1 मिमी तक) अपने स्तनधारी समकक्षों के साथ तुलना में है और अंक8टांके है, जो बार बार cryosections में कब्जा कर लिया है । इस प्रकार, पूरे लेंस sutural अखंडता का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं । के लिए पूर्वकाल सीवन गठन के vivo विश्लेषण में , और सटीक लेंस सेल वास्तुकला के इमेजिंग, हम mapple विशेष रूप से लेंस झिल्ली लेबलिंग को व्यक्त पराजीनी उत्पंन ।

लेंस झिल्ली पराजीनी के लाइव इमेजिंग के लाभ में शामिल हैं: 1) निर्धारण कलाकृतियों से परहेज, 2) समय चूक फिल्मों में गतिशील रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन, और 3) अनुदैर्ध्य अध्ययन है, जिसमें पहले घटनाओं बाद के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है सक्षम फीनोटाइप. परितारिका के वर्णकता सामान्य रूप से लेंस परिधि के स्पष्ट इमेजिंग रोकता है । 1 के अलावा-phenyl 2-thiourea (पीटीयू) primordia-5 से पहले (prim-5) चरण9 मेलोनोजेनेसिस और आंख pigmentation चारों ओर से रोकता है 4 दिन postनिषेचन (dpf) । हालांकि, 4 dpf के बाद, लेंस परिधि विशेष रूप से पुराने चरणों में, vivo मेंअस्पष्ट है । इसके अलावा, लेंस के घनत्व ही अपने पीछे के ध्रुव की इमेजिंग obscures । इसलिए, लेंस परिधि, या पीछे सीवन के आकारिकी अध्ययन करने के लिए, 4 dpf के बाद, लेंस के लिए excised और तय की जरूरत है ।

ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों vivo10में भ्रूणीय लेंस झिल्ली संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Q01 ट्रांसजेनिक एक सिवन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक झिल्ली लक्ष्यीकरण अनुक्रम, Gap43, EF1α प्रमोटर और लेंस फाइबर कोशिकाओं में हर जगह DF4 pax6 बढ़ाने तत्व के एक hexamer द्वारा संचालित करने के लिए संगलित व्यक्त करता है । Q01 है अतिरिक्त lenticular अभिव्यक्ति है, रेटिना में amacrine कोशिकाओं सहित, जो पृष्ठभूमि संकेत कहते हैं, अगर प्राथमिक ब्याज लेंस है । हम किसी भी अतिरिक्त लेन्टिकुलर संकेत से बचने के उद्देश्य के साथ, लेंस में विशेष रूप से एक झिल्ली tethered mApple व्यक्त करता है कि एक उपंयास ट्रांसजेनिक लाइन विकसित की है ।

लेन्स नाभिक स्थानीयकरण

हमें पता चला है कि लेंस नाभिक लार्वा zebrafish में एक प्रारंभिक पूर्वकाल स्थान से एक केंद्रीय स्थान के लिए आगे पीछे-वयस्क लेंस में धुरी कदम । उच्च अपवर्तनांक लेंस नाभिक की स्थिति में यह बदलाव zebrafish लेंस प्रकाशिकी1के सामांय विकास के लिए एक आवश्यकता माना जाता है । लेंस त्रिज्या के संबंध में हमारे तरीके लेंस परमाणु केंद्रीकरण की मात्रा की अनुमति देते हैं । इस विधि का प्रयोग, हम Aqp0a लेंस परमाणु केंद्रीकरण1के लिए आवश्यक है कि पता चला, और इस सरल विधि विकास और लेंस के फिजियोलॉजी और zebrafish मॉडल में अपनी ऑप्टिकल गुणों के अंय अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए एनिमल प्रोटोकॉल्स ऑप्थेल्मिक और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए एआरवीओ स्टेटमेंट का पालन करते हैं और यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया, इरविन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर ऐंड यूज कमिटी (IACUC) ने इसे मंजूरी दी है ।

1. जेब्राफिश पशुपालन और इच्छामृत्यु

  1. मानक प्रयोगशाला की शर्तों के तहत zebrafish (अब तनाव) उठाएंऔर बनाए रखें । भ्रूण मध्यम (EM)12भ्रूण उठाएं । जोड़ें ०.००३% PTU से EM करने के लिए 20-24 h postनिषेचन (पहले prim-5 चरण) भ्रूणों में वर्णक गठन को रोकने के लिए12 भ्रूणीय चरणों में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया9। 14 dpf जब तक जीवित rotifers के एक आहार पर 6-30 दिनों postनिषेचन (dpf) से लार्वा बढ़ा, और 14 dpf12के बाद रहते आर्टीमीशिया ।
    चेतावनी: PTU बहुत विषाक्त है
  2. संवेदनीकरण ट्राइकैन का उपयोग करते हुए जब तक कि स्पर्श के लिए उत्तरदायी न हो ।
    1. ४०० मिलीग्राम 3-एमिनो बेन्जोइक acidethylester, के साथ २.१ मिलीलीटर की 1 मीटर Tris (पीएच 9), ddh2ओ की १०० मिलीलीटर में के संयोजन से tricaine स्टॉक तैयार करें पीएच ७.० को समायोजित करें और-20 ° c पर स्टोर ।
      चेतावनी: ट्राइकेन विषाक्त है ।
    2. तनु ४.२ मिलीलीटर में ट्राईकेन स्टॉक के १०० मिलीलीटर में टैंक पानी की संवेदनीकरण करने के लिए लार्वा/वयस्कों या उन्हें संज्ञाशून्य करने के लिए भ्रूण (tricaine की अंतिम एकाग्रता में ०.०१६५% w/v) ।

2. भ्रूण और लार्वा का निर्धारण

नोट: Immunohistochemical प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित सामग्री7से अनुकूलित किया गया ।

  1. 4% (v/v) पैराफार्मलेडिहाइड (पीएफए) में फॉस्फेट बफर नमकीन (पी. बी. एस.) में 2 सप्ताह के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर dechorionated भ्रूण या लार्वा को ठीक करें ।
    चेतावनी: पीएफए दहनशील है और कैंसरजनक है ।
  2. धो भ्रूण PBS में 10 मिनट के लिए तीन बार, और 10% Triton और 1% DMSO (PBS-टी) के साथ PBS में permeabilize 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ।
    चेतावनी: DMSO विषाक्त है, घूस या त्वचा के अवशोषण द्वारा हानिकारक है, त्वचा के माध्यम से खतरनाक सामग्री किया जाता है, और दहनशील है । ट्राइटन विषाक्त, संक्षारक है और जलीय वातावरण के लिए खतरनाक है ।

3. लार्वा और वयस्क Zebrafish लेंस के विच्छेदन

  1. 6 dpf लार्वा से मछली को छूने के लिए गैर उत्तरदायी जब तक ट्राइकैन के साथ वयस्कता करने के लिए, लेकिन अभी भी एक मजबूत दिल की धड़कन दिखा रहा है । मापने के अनुसार मछली मानक लंबाई Schilling (२००२) के लिए13मचान के लिए ।
  2. तुरंत उत्पाद PBS में एक विच्छेदन डिश में सूक्ष्म विच्छेदन कैंची और जगह का उपयोग कर आंखें (वयस्क आंखों के लिए दिखाया2 चित्रा ) ।
    1. एक कस्टम ३५ mm लेंस dissections के लिए सिलिकॉन से भरा पकवान बनाओ । एक बार सिलिकॉन सेट किया गया है, आबकारी एक divot के आसपास व्यास में 2-3 मिमी और वयस्क आंखें immobilizing के लिए गहरी ०.५ mm/
  3. वयस्क zebrafish लेंस के विच्छेदन
    1. डिश divot पीछे की ओर PBS से भर में एक वयस्क आंख प्लेस । ऑप्टिक डिस्क के माध्यम से < 45 ° कोण पर संदंश डालने से आंख स्थिर । ध्यान रखें निक या लेंस सेक करने के लिए नहीं है । ऑप्टिक डिस्क से रेटिना और श्वेतपटल के माध्यम से दो या तीन रेडियल चीरों को विच्छेदन कैंची के साथ पक्ष्माभ क्षेत्र में बनाओ ।
    2. वापस रेटिना और श्वेतपटल फूल की पंखुड़ियों की तरह छील और आंख पलटी, कॉर्निया पक्ष ऊपर. कैंची के सपाट पक्ष के साथ श्वेतपटल और कॉर्निया के हेरफेर के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से लेंस स्थिर, जबकि दूर रेटिना और संदंश के साथ संलग्न ऊतकों खींच । लेंस से अतिरिक्त ऊतक को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें ।
      नोट: लगातार स्वस्थ लेंस प्राप्त करने के लिए ध्यान से काटना महत्वपूर्ण है ।
  4. लार्वा zebrafish लेंस के विच्छेदन
    1. एक लार्वा आंख पीछे की ओर रखें सिलिकॉन PBS से भरे पकवान के फ्लैट भाग पर ऊपर और एक तेज टंगस्टन सुई का उपयोग करने के लिए रेटिना और श्वेतपटल के माध्यम से रेडियल कटौती करते हुए एक और टंगस्टन सुई या संदंश के साथ आंख immobilizing ।
      नोट: लेंस को नुकसान न हो, इसका ध्यान रखें ।
      1. 10% में वायर टिप सस्पैंड द्वारा ०.१ mm टंगस्टन तार की एक 2 सेमी लंबाई की टिप पैनापन और एक कम वोल्टेज बारी-वर्तमान14लागू करने (w/ एक पाश्तूर पिपेट में गिलास एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर अंत पिघलने से सुई सुरक्षित ।
        नोट: वैकल्पिक ठीक विच्छेदन उपकरण भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
        चेतावनी: नाओह संक्षारक है ।
    2. धीरे से बाहर सुई के एक कुंद पक्ष के साथ वियोजित आंख से लेंस स्कूप, और ध्यान से दूर संलग्न ऊतक खींच ।

4. विच्छेदार लेंस का निर्धारण

  1. पीबीएस में १.५% (v/v) पीएफए में 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में विच्छेटेड लेंस को तुरंत ठीक करें । एक 10 मिनट के लिए PBS में तीन बार धो लेंस ।
  2. पूरे माउंट विश्लेषण या cryosectioning के लिए क्रायोप्रोटेक्ट के लिए लेंस permeabilize (अनुभाग 8 देखें) ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस-टी रात भर में लेंस permeabilize ।

5. लेंस Immunohistochemistry विज्ञान

  1. पीबीएस-टी में 4 ° ब् पर रात भर में Phalloidin-एलेक्सा फ्लूर ५४६ (1:200) और dapi के साथ सेल नाभिक (1:1000 की 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) में ऊष्मायन द्वारा फिक्स्ड भ्रूण/
    चेतावनी: DAPI एक त्वचा और आंख परेशान है ।
  2. प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी के साथ तीन बार धो लें । ऊष्मायन द्वारा ऊतक में 30%, ५०% और ७०% ग्लिसेरॉल में PBS-T (v/
  3. PBS-T (v/v) में ७०% ग्लिसर्ल में माउंट मछली के रूप में संभव के रूप में फ्लैट और सीधे कवर स्लिप के खिलाफ के रूप में आंखों के साथ कांच के नीचे ३५ mm microwell व्यंजनों पर । छोटी मछली के लिए, एक मामूली पूर्वकाल-पार्श्व झुकाव coverslip करने के लिए समानांतर होने के लिए लेंस सीवन उन्मुख करने के लिए मदद कर सकते हैं.

6. Zebrafish पूर्वकाल लेंस का विश्लेषण Vivo में एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग कर टांके

  1. टीजी (βB1cry: mAppleCAAX) लाइनों Tol2 किट15का उपयोग कर जनरेट करें । Tol2 transposable तत्व प्रणाली15 निर्माण के स्थिर एकीकरण जहां mapple मानव βB1के ३०० bp द्वारा संचालित-crystallin प्रमोटर सक्षम बनाता है16 caax अनुक्रम द्वारा झिल्ली को सीमित अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से लेंस फाइबर कोशिका झिल्ली में ।
    नोट: यह निर्माण (ID: 122451) खरीद के लिए उपलब्ध है ।
    1. इंजेक्शन की सुबह, इंजेक्शन मिश्रण तैयार है और बर्फ पर रखें । RNase-और DNase-मुक्त एच2ओ युक्त की 10 μl की एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए, जोड़ें: १.५-हूΒB1cry के Μl: mAppleCAAX डीएनए ५० एनजी/μl पर निर्माण [0.375-0.75 स्नातकोत्तर/अंतिम इंजेक्शन], ३०० एनजी/Μl (Tol2 किट) 15में १.५ μl Tol2 transposase एमआरएनए 15-30 अंतिम इंजेक्शन], और 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/अंतिम इंजेक्शन पर phenol लाल संकेतक के 1 μl] ।
    2. इंजेक्शन मिश्रण के 50-100 pL में 1-कोशिका चरण भ्रूण12सुई ।
  2. उपाय transgenesis क्षमता F0 में इंजेक्शन भ्रूण 3 dpf पर mApple सकारात्मक लेंस के साथ भ्रूण की आवृत्ति को मापने के द्वारा ।
    नोट: इस विधि का उपयोग कर > 80% transgenesis दक्षता की उंमीद है । F0 मोज़ाइक व्यक्तिगत कोशिकाओं की झिल्ली morphologies के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति । मोसिज्म के विभिंन स्तरों एक छवि को अनुमति देता है एक या कोशिकाओं के छोटे समूहों की morphologies, जबकि अधिक वैश्विक लेंस अभिव्यक्ति की अनुमति देता है vivo मेंलेंस टांके की तरह बहुकोशिकीय संरचनाओं के विश्लेषण ।
  3. मोज़ेक मछली F0 outcross स्थिर लाइनों, जो सभी फाइबर कोशिका झिल्ली लेबल उत्पंन करने के लिए । F0 संस्थापकों में ट्रांसजीन एकीकृत के साथ कोशिका जो जर्मलाइन स्थिर एकीकरण कि ट्रांसजेनिक लाइनों के रूप में बनाए रखा जा सकता है के साथ वंश उत्पन्न करेगा ।

7. Zebrafish पूर्वकाल लेंस का विश्लेषण Vivo में एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग कर टांके

  1. संवेदनीकरण 3 dpf या वयस्क मोज़ेक या स्थिर ट्रांसजेनिक मछली और 1% कम पिघल agarose (LMA) ग्लास नीचे microwell व्यंजन के कवर स्लिप के खिलाफ आंख फ्लैट के साथ tricaine साथ में माउंट ।
    1. 1% LMA बनाने के लिए (methylene नीले बिना) EM के १०० मिलीलीटर में LMA के 1 ग्राम भंग । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर स्टॉक के रूप में लंबी अवधि की दुकान । माइक्रोवेव स्टॉक को भंग करने और ४२ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए जब तक प्रत्येक ट्यूब का उपयोग किया जाता है ।
  2. कवर अप करने के लिए 6 dpf के साथ EM के साथ ट्राइकैन, या के साथ टैंक पानी के साथ वयस्कों के लिए tricaine जब LMA सेट है ।
    1. मिक्स के साथ methylene नीले या टैंक पानी के बिना एम के 5 मिलीलीटर tricaine स्टॉक की २५० μL और PTU के 7 μL यदि इमेजिंग PTU मछली का इलाज किया ।

8. लेंस Cryosectioning और Immunohistochemistry

  1. Cryoprotect फिक्स्ड भ्रूण या वयस्क लेंस में 10% सुक्रोज में रखने के द्वारा pbs (w/), 20% सुक्रोज के लिए 1 एच के लिए हर (या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर) और 30% सुक्रोज में रात में 4 ° c ।
  2. अक्तूबर में आधार molds में ऊतक एंबेड, और फिर 12-14 μm पर अक्टूबर Cryosection के साथ chucks पर स्थिर और एक Superfrost पर जमा/ 10 मिनट के लिए स्लाइड पर गर्म एक स्लाइड पर गरम वर्गों ~ ३५ ° c करने के लिए prewarmed ।
  3. प्रत्येक 10 मिनट के लिए PBS के साथ धारा तीन बार धो लो । Phalloidin के साथ लेबल वर्गों-Alexa आटा ५४६ (1:200) DAPI (1:1000) या WGA-Alexa आटा ५९४ (1:200) के साथ, तीन PBS washes द्वारा पीछा किया । विरोधी फीका बढ़ते मध्यम, और नेल पॉलिश के साथ सील coverslip के साथ माउंट ।

9. इमेजिंग

  1. संनाभि सूक्ष्मदर्शी से चित्र प्राप्त कीजिए । एक 60x N/A १.२ पानी-विसर्जन उद्देश्य, या इसी तरह, पूर्वकाल से पीछे लेंस ध्रुव के लिए विशिष्ट क्षेत्रों में उपयोग z-ढेर या ऑप्टिकल स्लाइसें प्राप्त करें । निंनलिखित अधिग्रहण सेटिंग्स का प्रयोग करें: १.२ हवादार डिस्क का उपयोग ५६१ एनएम लेजर, टेक्सास लाल फिल्टर phalloidin के लिए-Alexa आटा ५४६ या mApple, या ४०५ लेजर DAPI के लिए यूवी फिल्टर के साथ ।
  2. सही z-तीव्रता लेजर शक्ति लेंस में गहराई के साथ संकेत हानि प्रतिक्रिया करने के लिए । यह स्थिर और जीवित 3 dpf भ्रूण के पीछे ध्रुव पर एक मजबूत संकेत के लिए अनुमति देता है, और वयस्क मछली लेंस में भूमध्य ऑप्टिकल स्लाइस में मजबूत संकेत ।
  3. संकलन और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को देखने.

10. लेंस की माप पूर्वकाल-पश्च अक्ष में नाभिक स्थानीयकरण

  1. ओरिएंट हौसले से एक ३५ mm पकवान में pbs में अक्षत: लेंस के साथ एक coverglass नीचे, डंडे के साथ और ध्यान के हवाई जहाज़ के समानांतर समंवित टांके । अपवर्तनांक में अंतर के लिए देखो, जो आम तौर पर लेंस प्रांतस्था और लेंस नाभिक के इंटरफेस पर होता है लेंस नाभिक की पहचान करने के लिए ।
    नोट: स्वस्थ जंगली प्रकार वयस्क लेंस अत्यंत पारदर्शी यह मुश्किल लेंस टांके और नाभिक को देखने के लिए, या लेंस अभिविन्यास निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं. इस मामले में, लेंस कैप्सूल के लिए एक मामूली संदंश के साथ निक मामूली क्षति है, जो टांके और लेंस नाभिक स्पष्ट के बारे में 10 मिनट के लिए इस माप के लिए लेंस ओरिएंट में मदद करता है कारण बनता है । हालांकि, लेंस डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अनुपयोगी हो के रूप में वे अब क्षतिग्रस्त हो गई हैं ।
  2. के साथ या डीआईसी प्रकाशिकी एक संलग्न कैमरा के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के बिना उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत ध्यान में लेंस नाभिक के साथ लेंस के चित्र ले लो । अंशांकन के लिए एक ही आवर्धन के तहत छवि एक सूक्ष्ममापी ।
    1. लाइव देखें बटन पर क्लिक करें, लेंस नाभिक और लेंस परिधि कल्पना करने के लिए जोखिम सेटिंग्स को समायोजित, और तस्वीर शॉट बटन पर क्लिक करके एक छवि ले लो । एक tif फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
    2. अधिग्रहीत लेंस छवियों जांचना करने के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । सीधे लाइन उपकरण का चयन करें और सूक्ष्ममापी छवि पर ज्ञात लंबाई की एक पंक्ति आकर्षित, क्लिक करें विश्लेषण । स्केल सेट करें । ज्ञात दूरी, इकाइयों दर्ज करें और चुनें ' वैश्विक ' अंशांकन, और ठीक क्लिक करें ।
  3. लेंस नाभिक के केंद्र की दूरी को अग्रवर्ती ध्रुव (ं-र) से मापें ।
    1. एक अक्षीय अभिविन्यास में लेंस नाभिक के imaged केंद्र भर में एक लाइन आकर्षित करने के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में सीधी लाइन उपकरण का प्रयोग करें. लेंस नाभिक के केंद्र के रूप में इस लाइन के केंद्र ले लो ।
    2. लेंस के पूर्वकाल ध्रुव के लिए इस बिंदु से एक और रेखा ड्रा और ' विश्लेषण ' मेनू में ' उपाय ' का चयन दूरी को मापने के लिए (एक-r), जहां एक लेंस और आर की त्रिज्या है लेंस के केंद्र से दूरी है नाभिक.
    3. पूर्ववर्ती डंडे से एक और रेखा ड्रा और लेंस व्यास (2a) के रूप में इस दूरी को मापने । ' परिणाम ' खिड़की से इन लंबाई की प्रतिलिपि बनाएं और एक स्प्रेडशीट या सांख्यिकी कार्यक्रम के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: यह ठीक से पूर्वकाल ध्रुव के लिए नाभिक के केंद्र से मापने के लिए आसान है, लेंस नाभिक के केंद्र से लेंस के केंद्र से मापने की तुलना में. इस माप में सूत्र द्वारा कनवर्ट किया जाता है चरण 10.3.5 लेंस के केंद्र में लेंस नाभिक के केंद्र की दूरी की रिपोर्ट करने के लिए । हमेशा माप के लिए वयस्क नाभिक का उपयोग करें, भले ही भ्रूणीय नाभिक स्पष्ट है ।
    4. 2 से व्यास विभाजित, लेंस त्रिज्या, एककी गणना करने के लिए ।
    5. R/aकी गणना करें Equation 1 , जो लेंस त्रिज्या के सापेक्ष लेंस नाभिक का सामान्यीकृत स्थानीयकरण है ।
      नोट: पूर्वकाल ध्रुव के निकट स्थित नाभिक के लिए, r/a > 0.0 होगा, जबकि केंद्रीय स्थानीयकृत नाभिक में ०.० का r/a होगा ।
  4. एक मानक लंबाई के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत अक्षीय नाभिक माप के लॉग ग्राफ zebrafish विकास के दौरान लेंस नाभिक स्थानीयकरण में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए.

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Representative Results

वयस्क zebrafish नेत्र एनाटॉमी बारीकी से जैसा दिखता है कि स्तनधारियों (चित्र 1a) । Zebrafish और स्तनधारी आंखों के बीच कुछ मतभेदों के बावजूद, जैसे एक पक्ष्माभी शरीर के बजाय एक पक्षपाती क्षेत्र होने17, ऑप्टिकल गुण में अंतर18, और भ्रूणीय विकास के दौरान मोर्फोजेनेसिस में मतभेद19, zebrafish नेत्र नेत्र विकास और समझ नेत्र रोग20,21,22के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । एक सरल उपकला रेखाएं लेंस का अग्र ध्रुव, जो विषुवत वृत्त पर होता है, प्रसार, दीर्घीकरण की जीवन-दीर्घ प्रक्रिया और फाइबर कोशिकाओं में विभेदन, लेंस के पुंज का गठन करता है । परिपक्व फाइबर कोशिकाओं (चित्र 1b, हल्का नीला) पहले भ्रूण में अंतर, organelles के विहीन है और कभी नहीं बदल रहे हैं । अंतर फाइबर सेल टिप्स डंडे पर मिलने के लिए पूर्वकाल और पीछे टांके के रूप में । इन कोशिकाओं को तो नए विभेदित फाइबर कोशिकाओं द्वारा भली भांति हैं । सभी कशेरुकी लेंस की तरह, zebrafish लेंस इस प्रकार सबसे पुराने लेंस नाभिक के केंद्र में स्थित कोशिकाओं के साथ विकास की एक ढाल है । Zebrafish लेंस स्थाली रूपों पर 16 एच postनिषेचन (hpf), जो 18 hpf पर प्राथमिक लेंस फाइबर के रूप में लम्बी, और माध्यमिक फाइबर 28-36 hpf पर संक्रमण क्षेत्र के रूप में । पीछे सीवन ४८ hpf, जो पूर्वकाल सीवन दिखाई10हो जाता है से पहले है पर दिखाई देता है ।

इसके ऑप्टिक्स के लिए नियमित लेंस आर्किटेक्चर का सटीक विकास और रखरखाव जरूरी है । यहां हम zebrafish लेंस के विश्लेषण के लिए तरीकों का वर्णन विट्रो में कोशिका आकारिकी और vivo में, दोनों लाभ और सीमाएं, जो हम के नुकसान से उत्पंन फीनोटाइप का विश्लेषण विकसित सहित दो zebrafish Aqp0s के फंक्शन ंयूटेंट, Aqp0a और Aqp0b1। विट्रो मेंवयस्क लेंस आकारिकी के मूल्यांकन के लिए, लेंस विच्छेदित (चित्रा 2) और तुरंत तय हो गया था । भ्रूणीय आकलन पूरे स्थिर भ्रूण में किया गया था (चित्रा 3) और जीने के लिए ट्रांसजेनिक भ्रूण की तुलना में (चित्रा 4). Dissected और फिक्स्ड वयस्क लेंस (चित्रा 5) ट्रांसजेनिक वयस्क लेंस की तुलना में रहते थे imaged लाइव (चित्रा 6) । पता लगाने और इन पद्धतियों का उपयोग कर लेंस के विशिष्ट भागों के दृश्य में अंतर (तालिका 1) संक्षेप हैं ।

Phalloidin गेहूं के रोगाणु agglutinin (WGA) की तुलना में zebrafish में लेंस फाइबर सेल झिल्ली लेबलिंग के लिए बेहतर पाया गया था । WGA एक लेक्टिन है कि एन acetyl-डी glucosamine और sialic एसिड को बांध, और WGA fluorophores को संयुग्मित आम तौर पर मानव में लेंस फाइबर कोशिका झिल्ली लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है23, गोजातीय24, ovine25, माउस26, चूहा27 और zebrafish28,29। यहाँ हम पूरे zebrafish लेंस पर phalloidin का उपयोग करें (चित्रा 3, चित्रा 5).

7 dpf करने के लिए भ्रूणीय और लार्वा zebrafish लार्वा छोटे और पर्याप्त पारगंय लेंस बाहरी प्रांतस्था में phalloidin के प्रवेश की अनुमति देने के लिए कर रहे हैं । द्वारा 3 dpf लेंस नाभिक कॉंपैक्ट और organelles से रहित है, पूर्वकाल ध्रुव पर पूर्वकाल टांके फार्म (चित्रा 3a,B), और phalloidin एक इक्वेटोरियल ऑप्टिकल विमान में लेंस नाभिक से बाहर रखा गया है (चित्रा 3 सी,डी) । Phalloidin संभावना फाइबर कोशिका झिल्ली के उच्च संघन के कारण नाभिक से बाहर रखा गया है, पिछले अध्ययन के साथ संगत28. हालांकि, बाहरी प्रांतस्था इस धुंधला (चित्रा 3C-F) के साथ महान विस्तार में कल्पना की है । अनुप्रस्थ काट में, फ़ाइबर कोशिकाएं एक चपटे हेक्सागोनल आकार पर होती हैं, जिसमें लंबे चौड़े बाजू और छोटे संकीर्ण पक्ष होते हैं । Phalloidin दृढ़ता से दोनों संकीर्ण और व्यापक फाइबर कोशिका झिल्ली लेबल (चित्रा 3e-F) व्यापक पक्षों के बीच वल्कुट फाइबर कोशिकाओं के संघनक्रिया को उजागर. यह संगठन मोटे तौर पर aqp0a/b डबल म्यूटेंट में अप्रभावित है (चित्र 3बी, डी, एफ और एच) ।

Transgene के मोज़ेक अभिव्यक्ति (mapple मानव βB1 क्रिस्टेलाइन प्रमोटर के एक ३०० बीपी प्रमोटर क्षेत्र से प्रेरित caax आकृति द्वारा कोशिका झिल्ली को सीमित) दृढ़ता से 2 dpf में शुरू लेंस में व्यक्त करता है । ट्रांसजीन बेतरतीब ढंग से एक mApple की विषमय अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप जीनोम में एकीकृत है । हम कॉर्टेक्स में मजबूत अभिव्यक्ति के साथ एक 3 dpf लेंस के उदाहरण (चित्रा 4) और नाभिक के कुछ हिस्सों में अभिव्यक्ति (चित्रा 4d) दिखाते हैं । झिल्ली मार्कर phalloidin जैसे पारगम्यता द्वारा सीमित नहीं है, इस प्रकार यह लेंस नाभिक लेबल । मोज़ाइक (चित्रा 4) डीएनए इंजेक्शन है कि केवल कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट में व्यक्त कर रहे है द्वारा उत्पंन व्यक्तिगत कोशिका morphologies स्थिर लाइनों, जो हर कोशिका है कि βB1 क्रिस्टेलाइन व्यक्त लेबल की तुलना में विश्लेषण के लिए उपयोगी होते है (चित्रा 6) । टीजी में (βB1cry: mapplecaax) मोज़ाइक पूर्वकाल सीवन के आकारिकी में कल्पना किया जा सकता है पूर्वकाल ध्रुव पर लिया अनुमानों (चित्र 4a,बी) । ध्यान दें कि कोशिका झिल्ली की आकारिकी निश्चित लेंस phalloidin के साथ लेबल से अलग है (चित्रा 3a,B), और व्यापक कोशिका झिल्ली में उप की उपस्थिति (चित्रा 4aसफेद तीर) पहले से लेंस में अन्य से पहचाना प्रजातियों30 दिखाई है । हालांकि, संकीर्ण फाइबर कोशिका झिल्ली की कमजोर लेबलिंग के परिणामस्वरूप पूर्वकाल सीवन पर कोशिकाओं का हड़ताली अभिसरण देखने में असमर्थता (चित्र 4a,बी एरो) phalloidin के साथ लेबल फिक्स्ड लेंस में देखा (चित्र3 ए,बी तीर) ।

दिलचस्प है, लेंस भूमध्य रेखा पर ले लिया ऑप्टिकल स्लाइसें भी एक अलग लेबलिंग पैटर्न प्रकट, aqp0a में सेल मात्रा के लिए स्पष्ट अवरोधों के साथ / यह संभावना है क्योंकि ट्रांसजेनिक लेबल व्यापक फाइबर कोशिका झिल्ली phalloidin की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से । हम जेड के उपयोग के साथ पीछे सीवन की अखंडता का विश्लेषण करने के लिए पीछे पोल के माध्यम से z-अनुमानों को प्राप्त करने में सक्षम थे-सुधार, जो ऊतक में गहराई के साथ लेजर शक्ति में वृद्धि हुई । पश्च सीवन का स्पष्ट विश्लेषण (चित्रा 4g,एच) बरकरार मछली में पहले 5 dpf करने के लिए सीमित था, और उसके बाद लेंस बहुत घना था, लेंस के पीछे के हिस्से में संकेत की हानि में जिसके परिणामस्वरूप.

फिक्स्ड विच्छेदित वयस्क phalloidin के साथ लेबल लेंस के लिए फाइबर सेल पंक्तियों के उच्च आदेश दिया वास्तुकला में हड़ताली विस्तार से पता चला converging पूर्वकाल टांके फार्म (चित्रा 5a, तीर) और प्रांतस्था के आकारिकी (चित्रा 5c-H), कारण phalloidin द्वारा संकीर्ण फाइबर कोशिका झिल्ली की बहुत मजबूत लेबलिंग के लिए । अधिकतम Z-पूर्वकाल ध्रुव के अनुमानों aqp0a में एक तंग पूर्वकाल सीवन की हानि का पता चला /b डबल उत्परिवर्ती लेंस (चित्र 5b, तीर), wt की तुलना में (चित्रा 5a, तीर), जो स्पष्ट में झिल्ली और कोशिका नाभिक के एक द्रव्यमान के रूप में ऑप्टिकल पूर्वकाल ध्रुव (चित्र 5d) से 30 μm स्लाइस । गहरे ऑप्टिकल स्लाइस में, phalloidin लेबल गहरे लेंस प्रांतस्था और नाभिक से बाहर रखा गया था (चित्रा 5E,एफ) । बाहरी प्रांतस्था में फाइबर सेल पंक्तियों के समग्र संगठन कुछ हद तक aqp0a में एक तंग पूर्वकाल सीवन की कमी से प्रभावित था / यह असंभव इमेजिंग विमान के लिए बिल्कुल सीधा लेंस स्थिति बनाने ) WT लेंस की तुलना में (चित्रा 5e) । हालांकि, फाइबर सेल पंक्तियों के उच्च शक्ति छवियों भूमध्य रेखीय विमान में लिया पता चला कि बाहरी प्रांतस्था में कोशिकाओं को अभी भी अर्दली पंक्तियों का गठन, मजबूत संकीर्ण फाइबर सेल लेबलिंग के कारण दिखाई (चित्र 5g,एच). यह व्यक्तिगत फाइबर सेल व्यापक उनके तंग संघन का एक संयोजन के कारण झिल्ली विचार करने के लिए असंभव था, और कमजोर संकेत. चूंकि इन लेंस dissected थे, वे पीछे की ओर से रखा जा सकता है उद्देश्य का सामना करना पड़ रहा है, z-पीछे टांके है, जो पीछे फाइबर सेल युक्तियां के रूप में जीनोटाइप के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया के अनुमानों की अनुमति तंग टांके का गठन (आंकड़ा 5I,J तीर) ।

जेड-लाइव निश्चेष्ट वयस्क स्थिर टीजी (βB1cry: mAppleCAAX) के लेंस का अनुमान मछली पूर्वकाल प्रांतस्था में वल्कुट झिल्ली आकारिकी का पता चलता है (चित्र 6a,a '), साथ ही पूर्वकाल ध्रुव पर कोशिका अभिसरण की सीमा ( चित्र 6B) । यह अधिक करने के लिए लेंस इमेजिंग विमान के लंबवत टांके के साथ मछली माउंट मुश्किल था, तय विच्छेदित लेंस की तुलना में । लेंस नाभिक में ट्रांसजीन एक्सप्रेस mApple को ले जाने वाली स्थिर रेखाएँ (चित्र 6C,D) । भूमध्य रेखा पर ऑप्टिकल स्लाइसें एक मजबूत संकेत है जब पूर्वकाल प्रांतस्था के रूप में एक ही लेजर शक्ति के साथ imaged नाभिक के व्यापक संहनन का संकेत पता चला (चित्रा 6c) । दिलचस्प बात यह है कि बाहरी प्रांतस्था का कोई कोशिकीय विभेदन वयस्कों में स्पष्ट नहीं था, भ्रूणों के विपरीत । यह लेंस परिधि से एक स्पष्ट संकेत अवरुद्ध आईरिस के कारण होने की संभावना है । यह इमेजिंग करने से पहले पुतली के फैलाव द्वारा एक मजबूत लेंस वल्कुट संकेत प्राप्त करने के लिए संभव हो सकता है । कम लेजर शक्ति के साथ, यह लेंस नाभिक में कुछ कोशिका परतों भेद करने के लिए संभव था (चित्रा 6D). वयस्क zebrafish लेंस बहुत घना है, और यह विवो मेंपीछे ध्रुव से संकेत प्राप्त करने के लिए असंभव था ।

हमने दर्शाया है कि जेब्राफिश लेंस नाभिक, लार्वा लेंस में आरंभिक अग्रवर्ती स्थिति से व्यस्कों में एक केंद्रीय स्थिति में ऑप्टिकल अक्ष में जाताहै । इन आंदोलनों अक्षीय लेंस वर्गों में प्रकाश डाला, phalloidin और WGA लेंस नाभिक से बाहर रखा जाता है (चित्रा 7A-C) । हमने दिखाया है कि Aqp0a इस केंद्रीकरण प्रक्रिया1के लिए आवश्यक है, लेकिन इस तंत्र को अंय प्रोटीन से प्रभावित होने की संभावना है । लेंस नाभिक के केंद्र के पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ अपनी स्थिति के संबंध में स्थानीयकरण उनके axial उंमुखीकरण और डीआईसी रोशनी के तहत इमेजिंग में विच्छेदित पूरे लेंस रखने के द्वारा मापा गया था, इस प्रकार में मामूली अंतर पर प्रकाश डाला अपवर्तक गुण (चित्र 7E) । टांके आमतौर पर आसपास के प्रांतस्था की तुलना में एक अलग अपवर्तनांक है, तो उंमुखीकरण के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । युवा लार्वा लेंस अधिक स्पष्ट टांके है (बहुत युवा लेंस में पीछे टांके), और लेंस नाभिक, जो एक अलग अपवर्तक सूचकांक है, स्पष्ट रूप से असममित हैं, यह आसान इन चरणों में लेंस ओरिएंट करने के लिए बना रही है । लेंस के केंद्र से लेंस नाभिक (r) के केंद्र की सापेक्ष दूरी लेंस त्रिज्या (ए) के लिए सामान्यीकृत है. यह तो zebrafish विकास, जिसके लिए मानक लंबाई माप13प्रयोग किया जाता है के संबंध में हस्ताक्षर किए है । Wt में, लेंस नाभिक पूर्वकाल लेंस ध्रुव Equation 2 के करीब शुरू होता है, और फिर वयस्कता में केंद्रीकृत Equation 3 (चित्रा 7f) ।

Figure 1
चित्रा 1 : Zebrafish वयस्क नेत्र और लेंस आरेख । पूर्वकाल के रूप में लिया जाता है जहां प्रकाश आंख में प्रवेश करती है, जो zebrafish में वास्तव में पार्श्व है । (क) जेब्राफिश लेंस, कॉर्निया फोकस के साथ रेटिना पर प्रकाश होता है । जलीय जंतुओं में, कॉर्निया प्रकाश अपवर्तन में एक छोटी भूमिका निभाता है, लेकिन इसके बजाय, लेंस एक उच्च अपवर्तक सूचकांक18है । लेंस जलीय हास्य और पीछे काचयुक्त हास्य से भरा चैंबर से भरा पूर्वकाल चैंबर अलग करता है । (ख) जेब्राफिश लेंस स्तनधारी लेंस की तुलना में अधिक गोलाकार होता है । फाइबर सेल टिप्स बिंदु पर मिलने या नाल टांके8 पूर्वकाल और पीछे डंडे पर. लेंस प्रांतस्था में फाइबर कोशिकाओं में भिन्नता नाभिक और organelles है, जबकि परिपक्व लेंस नाभिक में फाइबर कोशिकाओं (हल्के नीले) organelles और नाभिक से रहित हैं. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।    

Figure 2
चित्रा 2 : Zebrafish लेंस विच्छेदन । (क) आंखों को निश्चेलित मछली से विच्छेलित किया जाता है और पीछे की ओर (ख) रखा जाता है । (ग) नेत्र को ऑप्टिक डिस्क (ओडी) के माध्यम से संदंश द्वारा स्थिर किया जाता है तथा ऑप्टिक डिस्क से जोन्यूल्स तक रेटिना तथा श्वेतपटल में दो से तीन रेडियल चीरे बनाए जाते हैं । (घ) लेंस को प्रकट करने के लिए फ्लैप को फोल्ड करें । (ड) आँख को कॉर्निया के ऊपर घुमाना, कॉर्निया के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से लेंस को स्थिर करना और श्वेतपटल-रेटिना को दूर करना । (च) शेष रेटिना तथा पक्ष्माभ क्षेत्र/जोन्यूल्स को लेंस से छांटना । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : भ्रूणीय लेंस में आकारिकी विट्रो। फिक्स्ड और permeabilized भ्रूणों phalloidin के साथ लेबल (लाल) और dapi के साथ सेल नाभिक (नीला) झिल्ली आकारिकी और डंडे में सीवन अखंडता प्रकट । Z-अनुमानों से पता चलता है कि WT और aqp0/b डबल उत्परिवर्ती लेंस बहुत नियमित रूप से फाइबर सेल व्यवस्था है कि एक बहुत तंग पूर्वकाल सीवन पर (तीर) से मिलने 3 Dpf (ए, बी) प्रदर्शन । भूमध्य रेखा पर लिए गए ऑप्टिकल स्लाइस हेक्सागोनल फाइबर कोशिकाओं की तंग पंक्तियों का पता चलता है दोनों जीनोटाइप में बाहरी प्रांतस्था में पैक (सी-एफ) । दोनों, फाइबर कोशिका झिल्ली के संकीर्ण और व्यापक पक्षों (ई) में दिखाया गया के रूप में चिह्नित कर रहे हैं. पश् चवर्ती सीवन (तीरों) आनुवंशिक रूपों (छ, भ्) दोनों में निर्मित तथा टाइट होते हैं इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : भ्रूणीय लेंस विवो मेंआकारिकी । एनक्थीटाइज़्ड की लाइव इमेजिंग 3 dpf मोज़ेक F0 इंजेक्शन टीजी (βB1cry: mapplecaax) लेंस पूर्वकाल टांके (तीर) z-अनुमानों में प्रकट (ए, बी) । (क) झिल्ली उप के रूप में स्पष्ट कर रहे है puncta (सफेद तीर) व्यापक फाइबर कोशिका झिल्ली में । संकीर्ण फाइबर कोशिका झिल्ली भी (काले तीर) स्पष्ट कर रहे हैं । Wt लेंस कसकर पैक लेंस वल्कुट फाइबर कोशिकाओं को प्रकट (सी, ई), aqp0a के बाधित प्रांतस्था की तुलना में- स्पष्ट सूजन कोशिकाओं (डी, एफ) के साथ । पीछे की ओर ध्यान केन्द्रित करते हुए (छ, ज) टांके (तीर) जीनोटाइप्स (जी, एच) के बीच कोई अंतर नहीं पता चलता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : वयस्क लेंस में आकृति विज्ञान विट्रो। 23 मिमी मानक लंबाई से अधिक मछली से excised, फिक्स्ड और permeabilized लेंस phalloidin (लाल) और DAPI (नीला) के साथ लेबल थे । १५० μm जेड-प्रोजेक्शन पूर्वकाल ध्रुव पर फाइबर सेल युक्तियों की सख्त व्यवस्था प्रकट WT (a) में एक तंग टांका (तीर) पर converging, लेकिन नहीं aqp0a/ एक ऑप्टिकल पूर्वकाल पोल से ४२ μm लिया स्लाइस का आदेश दिया कोशिकाओं WT में केंद्र में converging (सी), लेकिन नाभिक का एक द्रव्यमान जहां सीवन उत्परिवर्ती लेंस में होना चाहिए (D) । ऑप्टिकल स्लाइसें लेंस के भूमध्य रेखा के माध्यम से, पूर्वकाल ध्रुव से १३० μm पर प्रकट कसकर WT (ई, जी) और ंयूटेंट (एफ, एच) में फाइबर कोशिकाओं की पंक्तियों को पैक किया । पश्चवर्ती सीवन (तीरों) का गठन और दोनों जीनोटाइप्स में तंग है (मैं, जंमू) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 वयस्क विवो मेंलेंस आकारिकी । निश्चेलित वयस्क स्थिर टीजी (βB1cry: mAppleCAAX) wt लेंस की लाइव इमेजिंग । Z-पूर्वकाल प्रांतस्था में प्रक्षेप वल्कुट आकारिकी (ए, ए '), और अग्र सीवन (तीर), एक एकल ऑप्टिकल स्लाइस (B, arrow) में एक बिंदु पर converging कक्षों के साथ । कॉर्टेक्स भूमध्य रेखा के माध्यम से एक ऑप्टिकल स्लाइस में उच्च लेजर शक्ति पर कल्पना की जा सकती (सी), मजबूत संकेत के रूप में लेंस नाभिक (डी) की तुलना में । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: Zebrafish लेंस नाभिक केंद्रीकरण । स्थिर और cryoprotected भ्रूण (ए) और लेंस (ख, ग) अक्षत: थे-sectioned और phalloidin के साथ लेबल-५४६ (एक में लाल, बी), dapi (एक में नीला , बी) या wga-५९४ ( सीमें लाल) । लेंस नाभिक कोशिका नाभिक से रहित है, और 3 dpf (एक) में पूर्वकाल (a) लेंस के करीब रखा गया है, और 1 महीने पुराने लेंस (ख) में, केंद्रीय वयस्क लेंस में रखा जा रहा है की तुलना में (ग) । ४.१ मिमी मानक लंबाई के एक महीने पुराने zebrafish से dissected लेंस उंमुख equatorially (डी) थे, या अक्षत: (ई) । अक्ष में लेंस नाभिक के सापेक्ष स्थानीयकरण निम्नलिखित रणनीति का उपयोग कर की गणना की गई थी: (E) लेंस नाभिक के केंद्र (*) की दूरी (सफेद बिंदीदार रेखा) पूर्वकाल ध्रुव के लिए मापा गया था, के रूप में यह मापने की तुलना में अधिक व्यावहारिक लेंस (प्लस) के केंद्र के लिए दूरी (आर) । यह लेंस त्रिज्या (ए), जो शुरू रूप में axial (चींटी.-pos.) लेंस व्यास के रूप में मापा गया था सामांयीकृत किया गया था । सामान्यीकृत अक्षीय नाभिक स्थानीयकरण के लॉग को zebrafish विकास के एक समारोह के रूप में, मानक लंबाई (एफ) द्वारा मापा गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

सुविधा आईएचसी भ्रूण टीजी भ्रूण पूरे IHC वयस्क लेंस टीजी एडल्ट
रहना एन वाई एन वाई
अग्रसीवन वाई कुछ वाई कुछ
पश् च सीवन वाई वाई वाई एन
वल्कुट कोशिकीय विस्तार कुछ वाई वाई अग्र कुछ
लेन्स नाभिक विस्तार एन Y (स्थिर) एन Y (स्थिर)
द्वितीयक लेबल Y-एंटीबॉडी केवल टीजी के साथ ही जीते Y-एंटीबॉडी केवल टीजी के साथ ही जीते
चौड़े/ दोनों व्यापक ज्यादातर संकीर्ण व्यापक

तालिका 1: zebrafish में लेंस आकारिकी के विश्लेषण के लिए vivo बनाम इन विट्रो तरीकों की तुलना का सारांश । Y = हां, N = नहीं

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Discussion

Zebrafish लेंस आकारिकी का विश्लेषण ंयूटेंट में फीनोटाइप को समझने में प्रारंभिक कदम है, या औषधीय हस्तक्षेपों के प्रभाव नेत्र लेंस के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के उद्देश्य से । हम तरीके लेंस टांके, वल्कुट फाइबर सेल आकारिकी और लेंस नाभिक के पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए रूपरेखा । इन विट्रो में और Vivo में ( तालिका 1 में तुलना में) का एक संयोजन कर रहे हैं । इन विट्रो तरीकों बाहरी वल्कुट सेल morphology के अधिक से अधिक विस्तार के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही वयस्क लेंस में पीछे सीवन के लिए उपयोग.

Vivo में विश्लेषण ट्रांसजेनिक मार्कर के उपयोग के साथ संभव है । ट्रांसजीन हम यहां परिचय लेंस झिल्ली विशिष्ट है, मौजूदा Q01 zebrafish लाइन है, जो जबकि लेबल लेंस भी लेबल आंख में अंय प्रकार के सेल, amacrine कोशिकाओं सहित, व्याख्या उलझी की तुलना में11 . Vivo में संकेत आंख के pigmented उपकला, जो embryogenesis के दूसरे दिन के दौरान रूपों द्वारा सीमित है, तो भ्रूण इस और बाद के चरणों में विश्लेषण के लिए इलाज ptu होने की जरूरत है । वयस्कों में, आइरिस obscures लेंस प्रांतस्था के स्पष्ट विश्लेषण, लेकिन के लिए अनुमति देता है पूर्वकाल लेंस प्रांतस्था के vivo विश्लेषण में । मछली लेंस की लाइव इमेजिंग एक ही जानवर में लेंस आकारिकी के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यह इस तरह के परासरणी या औषधीय perturbations के जवाब में सेल मात्रा व्यवधान के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण हो सकता है । एक अप्रत्याशित निष्कर्ष यह है कि हम स्पष्ट रूप से लाइव लार्वा transgenics में व्यापक फाइबर कोशिका झिल्ली में झिल्ली उप-डोमेन कल्पना कर सकते हैं, लेकिन फिक्स्ड लेंस में नहीं. यह ट्रांसजीन और phalloidin द्वारा लेबलिंग में अंतर को उजागर करता है, साथ ही तथ्य यह है कि इन उप-डोमेन निर्धारण प्रक्रिया से प्रभावित हो सकता है ।

लेंस के आणविक तंत्र का विश्लेषण नाभिक केंद्रीकरण तरीकों हम का वर्णन का उपयोग लेंस ऑप्टिकल गुणों के विकास के लिए आवश्यक तंत्र को उजागर कर सकते हैं । हालांकि, तिथि करने के लिए, अक्षीय लेंस नाभिक विषमता केवल zebrafish में रिपोर्ट किया गया है, इस प्रक्रिया का अध्ययन करके हम अंय प्रजातियों में लेंस प्रकाशिकी के विकास के लिए आवश्यक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की संभावना है । भविष्य में, ट्रांसजेनिक जानवरों अन्य अनुप्रयोगों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है-जैसे ओवरएक्सप्रेशन अध्ययन, एक हरे रंग की ट्रांसजेनिक मार्कर के उपयोग के साथ. ये लेंस में एक विशिष्ट प्रोटीन overexpressing के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या मौजूदा म्यूटेंट में फीनोटाइप के बचाव के लिए.

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Disclosures

हमारे पास कोई प्रकटीकरण नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने वित्तपोषण के स्रोत को स्वीकार करना चाहते हैं: NIH R01 EY05661 के लिए, Ines Gehring को aqp0a पैदा करने के साथ सहायता के लिए... । Blumberg और डॉ केन उनके विदारक सूक्ष्मदर्शी के उपयोग के लिए है चो लैब्स, और डॉ Megan सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ मदद के लिए स्मिथ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

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References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

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Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

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