Summary
यहाँ प्रस्तुत उच्च घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स से तंत्रिका जनक कोशिकाओं में समृद्ध neurospheres की सहज पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल है. एक ही प्रयोग के दौरान, जब न्यूरॉन्स एक कम घनत्व पर चढ़ाया जाता है, प्रोटोकॉल भी लंबे समय तक प्राथमिक चूहे न्यूरॉन संस्कृतियों में परिणाम.
Abstract
प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक आवश्यक तकनीक है. मस्तिष्क में गहरी मशीनी अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, यह विभिन्न न्यूरोबायोलॉजी अध्ययन के लिए शोषण किया जा सकता है कि इन विट्रो मॉडल में एक मजबूत करने के लिए आवश्यक है। हालांकि प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों (यानी, लंबी अवधि के हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों) मॉडल के साथ वैज्ञानिकों प्रदान की है, यह अभी तक मस्तिष्क नेटवर्क की जटिलता पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इन सीमाओं के मद्देनजर, एक नया मॉडल neurospheres, जो मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एक करीब समानता भालू का उपयोग कर उभरा है. वर्तमान प्रोटोकॉल मिश्रित cortical और हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के उच्च और निम्न घनत्व की चढ़ाना भ्रूण दिन 14-16 Sprague Dawley चूहों के भ्रूण से अलग का वर्णन करता है. यह neurospheres और दो स्वतंत्र प्लेटफार्मों के रूप में दीर्घकालिक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति की पीढ़ी के लिए आगे के अध्ययन का संचालन करने के लिए अनुमति देता है. यह प्रक्रिया बेहद सरल और लागत प्रभावी है, क्योंकि यह कई चरणों और अभिकर्मकों को पहले न्यूरॉन संस्कृति के लिए आवश्यक समझा कम से कम. यह कम से कम आवश्यकताओं है कि प्राप्त परिणामों के साथ किया जा सकता है और आगे तंत्रिका विज्ञान से संबंधित अध्ययन की विविधता के लिए इस्तेमाल के साथ एक मजबूत प्रोटोकॉल है.
Introduction
मस्तिष्क न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की एक जटिल परिपथ है। वर्षों से, वैज्ञानिक इस जटिल मशीनरी में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की कोशिश कर रहे हैं। ऐसा करने के लिए, न्यूरोसाइंटिस्ट्स ने शुरू में जांच के लिए विभिन्न रूपांतरित तंत्रिका-आधारित सेल लाइनों का सहारा लिया। तथापि, इन क्लोनल सेल लाइनों की अक्षमता मजबूत synaptic कनेक्शन और उचित axons या dendrites बनाने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों1,2के लिए वैज्ञानिक रुचि स्थानांतरित कर दिया है. प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति का सबसे रोमांचक पहलू यह है कि यह जीवित न्यूरॉन्स3का निरीक्षण करने और हेरफेर करने का अवसर पैदा करता है . इसके अलावा, यह तंत्रिका ऊतक की तुलना में कम जटिल है, जो यह समारोह और विभिन्न न्यूरॉन प्रोटीन के परिवहन के अध्ययन के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है. हाल ही में, माइक्रोस्कोपी, जीनोमिक्स, और प्रोटीओमिक्स के क्षेत्र में कई घटनाओं ने न्यूरोसाइंटिस्टों के लिए न्यूरॉन संस्कृतियों का दोहन करने के लिए नए अवसर पैदा किएहैं 4।
प्राथमिक संस्कृतियों neuroscientists तंत्रिका विकास के पीछे आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए, विभिन्न तंत्रिका संकेतन रास्ते का विश्लेषण, और synapsis के एक अधिक सुसंगत समझ विकसित करने की अनुमति दी है. हालांकि तरीकों की एक संख्या प्राथमिक न्यूरॉन्स से संस्कृतियों की सूचना दी है (ज्यादातर हिप्पोकैम्पस मूल से5,6,7), एक रासायनिक परिभाषित माध्यम है कि न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक संस्कृति सक्षम बनाता है के साथ एक एकीकृत प्रोटोकॉल है अभी भी जरूरत है. हालांकि, न्यूरॉन्स एक कम घनत्व पर चढ़ाया सबसे अधिक बार मनाया जाता है, जो लंबे समय तक जीवित नहीं है, त्रीस समर्थन की कमी के कारण होने की संभावना8 कि आसन्न न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं द्वारा प्रदान की जाती है. कुछ विधियों ने ग्लिल कोशिकाओं के साथ प्राथमिक न्यूरॉन्स को सह-कुलीकरण का सुझाव भी दिया है, जिसमें ग्लिल कोशिकाओं का उपयोग फीडर परत9के रूप में किया जाता है। हालांकि, ग्लिल कोशिकाएं उनके अतिवृद्धि के कारण बहुत सी समस्याएं पैदा करती हैं, जो कभी-कभी न्यूरोनल वृद्धि को ओवरराइड करतीहैं 10। इसलिए, ऊपर की समस्याओं पर विचार, एक सरल और अधिक लागत प्रभावी प्राथमिक तंत्रिका संस्कृति प्रोटोकॉल की आवश्यकता है, जो जांच के लिए neurobiologists और neurochemists दोनों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति अनिवार्य रूप से 2 डी संस्कृति का एक रूप है और plasticity, स्थानिक अखंडता, या मस्तिष्क की विषमता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इससे एक अधिक विश्वसनीय 3 डी मॉडल की आवश्यकता बढ़ गई है जिसे न्यूरोस्फीयर11,12कहा जाता है . Neurospheres neuroscientists के लिए एक उपन्यास मंच प्रस्तुत, असली करने के लिए एक करीब समानता के साथ, विवो मस्तिष्क13में . Neurospheres कोशिकाओं है कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी), तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी), न्यूरॉन्स, और astrocytes में अमीर हैं की गैर-अनुकूल 3 डी समूहों रहे हैं। वे तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और तंत्रिका जनक कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उत्कृष्ट स्रोत हैं, जो विभिन्न न्यूरॉन और गैर-न्यूरोनल वंश में भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर, neurosphere संस्कृतियों के भीतर परिवर्तनशीलता पहले की सूचना दी प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादित एक एकीकृत neurosphere संस्कृति प्रोटोकॉल14के निर्माण के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है.
इस पांडुलिपि एक प्रोटोकॉल है जिसमें यह एक मिश्रित cortical और हिप्पोकैम्पस संस्कृति से सेल चढ़ाना घनत्व बारी द्वारा दोनों 2 डी और 3 डी प्लेटफार्मों उत्पन्न करने के लिए संभव है प्रस्तुत करता है। यह देखा गया है कि 7 दिनों के भीतर मुक्त चल neurospheres उच्च घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स E14-E16 Sprague Dawley चूहा भ्रूण से अलग से प्राप्त कर रहे हैं, जो आगे की संस्कृति पर, पुल फार्म और रेडियल glial की तरह एक्सटेंशन के माध्यम से interconnections. इसी तरह, कम घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स में, एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति है कि अप करने के लिए बनाए रखा जा सकता है 30 दिनों के रखरखाव माध्यम प्रति सप्ताह दो बार बदलकर प्राप्त की है.
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Protocol
सीएसआईआर-भारतीय रासायनिक जीव विज्ञान संस्थान (आईआईसीबी/एईसी/बैठक/अप्रैल/2018/1) की संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा पशु से संबंधित सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया था।
1. अभिकर्मक और मीडिया की तैयारी
- पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) समाधान: डीआयनित जल में 0ण्1 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर पीडीएल समाधान तैयार करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
- वियोजन माध्यम: बाँझ, फ़िल्टर्ड deionized पानी के 1 एल करने के लिए, संबंधित सांद्रता में निम्नलिखित घटकों गठबंधन: सोडियम क्लोराइड (8 मिलीग्राम/एमएल), पोटेशियम क्लोराइड (0.4 mg/mL), पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक (0.06 मिलीग्राम/एमएल), डी-ग्लूकोज (1 मिलीग्राम/ सोडियम फॉस्फेट डाइबेसिक (0.479 मिलीग्राम/एमएल), और 1 एम हेप्स [4-(2-हाइड्रॉक्सीएथिल)-1-पिपरैजीनथेथेनसल्फोनिक एसिड; 10 एम.एम.]। भंवर उपयोग जब तक उचित मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर सहायता करने के लिए सभी घटकों।
नोट: वियोजन के दौरान बर्फ ठंडा रूप में विभाजन माध्यम का प्रयोग करें, लेकिन कमरे के तापमान पर (आरटी) धोने और अन्य प्रयोजनों के लिए। - प्लेटिंग माध्यम: चढ़ाना मध्यम निम्नलिखित के होते हैं: न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) अर्ल के संतुलित नमक समाधान (बीएसएस; 88.4%), डी-ग्लूकोज (0.6%), घोड़े सीरम (10%), और पेनिसिलिन / संबंधित अनुपात में घटकों का मिश्रण है और बाँझ शर्तों के तहत एक हुड के अंदर प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
नोट: हमेशा किसी भी घटक की गिरावट से बचने के लिए ताजा तैयार चढ़ाना माध्यम का उपयोग करें। - रखरखाव माध्यम: संबंधित अनुपात में निम्नलिखित के संयोजन के द्वारा रखरखाव माध्यम तैयार: neurobasal माध्यम (97%), 0.5 mM वाणिज्यिक glutamine नमूना प्राप्त, B27 सीरम मुक्त पूरक (2%), और पेनिसिलिन / संबंधित अनुपात में घटकों का मिश्रण है और बाँझ शर्तों के तहत एक हुड के अंदर प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं। सुनिश्चित करें कि सभी घटकों को ताजा तैयार कर रहे हैं.
2. कवरलिप्स की तैयारी
- एक 12 मिमी व्यास गोल गिलास कवरस्लिप लें और इसे 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) में 4 एच के लिए भिगो दें।
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके आसुत जल में कवरलिपों को स्थानांतरित करें और एसिड से पूरी तरह से छुटकारा पाने के लिए इसे धीरे-धीरे घुमाएं।
- 100% इथेनॉल युक्त एक बीकर में सफाई के एक अतिरिक्त दौर के लिए washed coverslips स्थानांतरण.
- कवरलिप्स का उपयोग करने से पहले, उन्हें टिशू पेपर पर रखकर लेमिनर हुड में अच्छी तरह से सुखाएं।
3. न्यूरॉन संस्कृति के लिए पॉली-डी-लाइसिन लेपित प्लेटों की तैयारी
- दो 24 अच्छी तरह से प्लेटें ले लो: उच्च घनत्व चढ़ाना के लिए एक और कम घनत्व चढ़ाना के लिए एक और। बाँझ पैकेट केवल लेमिनर हुड के अंदर खोलें.
- 24 अच्छी तरह से प्लेटों में बाँझ कांच coverslips के 12 मिमी स्थानांतरण.
- प्रत्येक कुएं में पीडीएल विलयन (0.1 मिलीग्राम/एमएल) के 300 डिग्री सेल्सियस डालो ताकि यह पूरी तरह से कवरलिप्स की सतह को कवर कर सके।
- सुखाने को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों लपेटें और रात भर सीओ2 इनक्यूबेटर में रखने के लिए।
- अगले दिन (प्लेटिंग से पहले), PDL समाधान aspirate और बाँझ deionized पानी के 300 डिग्री सेल्सियस के साथ ठीक से धोने दो से तीन बार.
- ताजा तैयार चढ़ाना मध्यम के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और प्लेटों चढ़ाना जब तक इनक्यूबेटर के लिए वापस।
4. भ्रूण को हटाना और decapitation
नोट: 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस (15 साई) पर एक ऑटोक्लेव में एल्यूमीनियम पन्नी में पैक सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों स्टरलाइज़ करें। यह कुंद अंत कैंची, संदंश, ठीक संदंश, दो ठीक कैंची, और पूरी प्रक्रिया के लिए एक धमनी forceps की एक जोड़ी भी शामिल है.
- न्यूरॉन्स और neurospheres पैदा करने के लिए, एक समय पर गर्भवती Sprague Dawley चूहे का उपयोग करें और E0 के रूप में योनि प्लग का पता लगाने के साथ दिन के निशान.
नोट: संस्कृति E14-E16 के बीच किया जाना चाहिए। - संस्कृति के दिन, बर्फ पर एक बाँझ कांच पेट्री प्लेट जगह है और यह ठंड हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ भरें।
- एक E14-E16 गर्भवती चूहे के साथ एक इंट्रापेरिटोनल (आई.पी.) इंजेक्शन 90 मिलीग्राम केटामाइन/किलोग्राम शरीर के वजन और 10 मिलीग्राम xylazine/
नोट: चूहे भी पेंटोबार्बिटल की अधिक मात्रा या xylazine या diazepam के साथ केटामाइन की अधिक मात्रा से euthanized किया जा सकता है. - 70% इथेनॉल छिड़काव द्वारा बांध के पेट को बाँझ और बाँझ बलप्स और कुंद अंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर पेट क्षेत्र में एक वी के आकार का कटौती कर.
- भ्रूण की थैली को ठंडे एचबीएसएस घोल के साथ पेट्री प्लेट पर ध्यान से लें।
नोट: एक ही संदंश और कैंची है कि सिर्फ त्वचा के लिए इस्तेमाल किया गया का उपयोग न करें, क्योंकि यह आंतरिक अंगों को दूषित करेगा. आंतरिक अंगों के लिए कैंची/बल्स के एक अलग सेट का उपयोग करें। - भ्रूण को ताजा, ठंडे एचबीएसएस में भ्रूण की थैली से बाहर ले लो।
- बाँझ कैंची के साथ सिर decapitate.
5. हिप्पोकैम्पस के साथ मस्तिष्क और प्रांतस्था के विच्छेदन को हटाना
- शुरू करने से पहले, ठंड, बाँझ HBSS के साथ 90 मिमी बाँझ पेट्री व्यंजन भरें।
- बाँझ, कुंद एंडेड ड्रेसिंग संदंश का उपयोग कर बाँझ व्यंजन में सिर स्थानांतरण।
- स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, बाँझ, serated बलकेप के साथ snout क्षेत्र से सिर पकड़ और त्वचा और खोपड़ी खुला काटने से मस्तिष्क को हटा दें।
- HBSS समाधान में एक ही तरीके से सभी भ्रूण दिमाग ले लीजिए.
- brainstem धारण करके गोलार्द्धों और midbrain से सभी meninges निकालें.
- ध्यान से मशरूम टोपी है कि हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था होते हैं जैसे बरकरार गोलार्द्धों को हटा दें।
- 15 एमएल शंकुन ट्यूब में प्रांतस्था और अक्षुण्ण हिप्पोकैम्पस युक्त गोलार्द्धों को एकत्र करें जिसमें 10 एमएल वियोजन माध्यम शामिल हैं।
6. एकल न्यूरॉन्स में cortical और हिप्पोकैम्पस ऊतक के विघटन
- एकत्र ऊतकों को व्यवस्थित करने और वियोजन माध्यम को प्रेरित करने की अनुमति दें, इसमें 5%-10% माध्यम को छोड़ दें।
- ऊतक के लिए ताजा वियोजन माध्यम के 10 एमएल जोड़ें, और चरण 6.1 दोहराएँ दो बार.
- वियोजन माध्यम का 4.5 एमएल और 0.5 एमएल 0.25% (1x) ट्रिप्सिन एड्टा (एथिलीन डायमिन टेट्राऐसीटेट) विलयन जोड़ें।
- पाचन आगे बढ़ने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में ऊतक रखें।
- मध्यम को प्रेरित करें और डाइजेच किए गए ऊतकों में लगातार 10 एमएल वियोजन और चढ़ाना माध्यम जोड़ें।
- पचे हुए ऊतकों को व्यवस्थित होने दें और वियोजन माध्यम को प्रेरित करें। चढ़ाना मध्यम के 2.5 एमएल जोड़ें और एक 90 मिमी बाँझ पकवान के आधार में डालना.
- न्यूनतम मात्रा पर कब्जा करने के लिए एक 1,000 $L पिपेट टिप का उपयोग कर के पकवान के कोने आधार में पचा ऊतकों triturate।
- प्राप्त सेल निलंबन को 70 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से पास करें, ऊतक के किसी भी हिस्से को छोड़कर।
- trypan नीले रंग बहिष्करण विधि का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण और एक स्वचालित सेल काउंटर में कोशिकाओं की संख्या गिनती.
- trypan नीले रंग बहिष्करण विधि के लिए, सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस और 0.4% trypan नीले दाग के 10 डिग्री एल ले, अच्छी तरह से मिश्रण, और डिस्पोजेबल कक्ष स्लाइड के दो संलग्न कक्षों में से एक में मिश्रण के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
- सेल काउंटर में मिश्रण युक्त स्लाइड डालें और पढ़ने प्राप्त करें।
नोट: trypan नीले रंग का बहिष्करण विधि सिद्धांत है कि जीवित कोशिकाओं पर आधारित है (उनके बरकरार झिल्ली के कारण) trypan नीले रंग डाई बाहर होगा और इसलिए एक स्पष्ट कोशिका द्रव्य दिखाएगा, एक गैर व्यवहार्य कोशिका है कि आसानी से trypan नीले ले जाएगा की तुलना में और नीले रंग में दिखाई देते हैं रंग15|
- उच्च घनत्व के लिए 1.5 x 105 कोशिकाओं/एमएल को प्लेट करने के लिए प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और प्लेटिंग माध्यम के प्रत्येक 30 एमएल वाले दो अलग-अलग ट्यूबों में कम घनत्व के लिए 20,000 कोशिकाओं/एमएल को अलग करें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से और प्लेट 500 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से चढ़ाना माध्यम में बिखरे से पहले जोड़ा चढ़ाना माध्यम aspirate।
- उसके बाद प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में और 5% ब्व्2 को 4 ज के लिए वापस कर दें।
- प्लेटिंग के बाद माइक्रोस्कोप 4 एच के तहत पालन के लिए कोशिकाओं की जांच करें।
- यदि दोनों प्लेटों में कोशिकाओं का उचित पालन है, तो प्रत्येक कुएं में मध्यम को 500 डिग्री सेल्सियस के साथ नए रखरखाव माध्यम से बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- संस्कृति इन न्यूरॉन्स प्रति सप्ताह रखरखाव मध्यम 2x बदलकर 30 दिनों के लिए कम घनत्व पर हो.
- उन्हें अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों को स्थानांतरित करके एक ही रखरखाव माध्यम में उच्च घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स से प्राप्त neurospheres संस्कृति.
- उन्हें महत्वपूर्ण मार्करों के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा न्यूरॉन्स और neurospheres की विशेषता. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए, पहले प्लेट पर 30 मिनट के लिए 4% फार्मेल्डिहाइड का उपयोग करके कोशिकाओं/न्यूरोस्फीयरको ठीक करें, फिर 10 मिनट के लिए 0.1% गैर-आयनिक डिटर्जेंट के साथ कोशिकाओं को permebilize करें।
- दोनों न्यूरॉन्स के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (एंटी-टज1, GFAP, O4, Tau) और neurospheres (एंटी-नेस्टिन, GFAP, Tuz1) फॉस्फेट-बफर नमकीन में (पीबीएस) 1:300 सांद्रता में और 4 डिग्री सेल्सियस16पर रात भर इनक्यूबेट .
नोट: तुज1 (वर्ग III जेड-ट्यूबुलिन) और ताओ प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए सकारात्मक मार्कर हैं, जबकि GFAP (ग्ियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन) और O4 (ओलिगोडेनड्रोसाइट मार्कर) प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए नकारात्मक मार्कर हैं17,18. neurospheres के मामले में, तुज1, GFAP, और Nestin सभी सकारात्मक मार्करों के रूप में सेवा19,20. - अगले दिन, एक या दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और 2 एच के लिए आरटी पर 1:600 सांद्रता पर पीबीएस में उचित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
नोट: विरोधी Mouse या विरोधी Rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ा की मेजबान प्रजातियों के आधार पर चयन कर रहे हैं. यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रयोजनों के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट डेरिवेटिव के लिए संयुग्मी होना चाहिए। - कोशिकाओं को एक या दो बार पीबीएस से फिर से धोएं।
- Hoechst 33258 (1 मिलीग्राम/ स्टॉक समाधान से पीबीएस में 0.1% Hoechst समाधान तैयार करें और इसे कोशिकाओं में जोड़ें।
- 30 मिनट के लिए 0.1% Hoechst समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के साथ फिर से धो लें।
- स्लाइड पर 20 डिग्री पीबीएस (या बढ़ते माध्यम) जोड़ें और धीरे-धीरे पीबीएस युक्त स्लाइड के क्षेत्र पर दागी कोशिकाओं वाले कवरस्लिप को माउंट करें। डाइब्यूटिलफ्थैलेट पॉलीस्टाइरीन जाइलीन (DPX) के साथ कवरस्लिप के मार्जिन को सील करें।
- 10x और 40x आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के तहत निश्चित कोशिकाओं की इमेजिंग प्रदर्शन.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में, एक सरल रणनीति स्पष्ट किया गया है जिसमें चर सेल चढ़ाना घनत्व दो अलग तंत्रिका स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों से प्राप्त कर रहे हैं. चित्र 1क,ख क्रमशः उच्च और निम्न घनत्व प्लेटेड कोशिकाओं में न्यूरॉन्स चढ़ाना के 4 एच के बाद कोशिकाओं के पालन को दिखाता है। चित्र 1में दर्शाए अनुसार न्यूरॉन्स के उचित पालन को देखने पर, प्लेटिंग माध्यम को प्रत्येक कुएं में रखरखाव माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया और इस प्रकार 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में लौट आया। उच्च घनत्व प्लेट्ड न्यूरॉन्स में तुलनात्मक रूप से अधिक कोशिका पालन देखा गया. चढ़ाना के 24 एच के बाद, दोनों उच्च और कम घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स विस्तृत न्यूरॉन विस्तार और synaptic interconnections दिखाया, के रूप में चित्र 2A,बीमें अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों में मनाया.
चित्र 3कमें, संस्कृति में 7 दिनों के बाद कम घनत्व प्लेटेड न्यूरॉन्स की एक चरण-कंट्रास्ट छवि का प्रतिनिधित्व किया जाता है। यहाँ, न्यूरॉन्स डेन्ड्रिटिक शाखाओं से मिलकर एक विस्तृत synaptic नेटवर्क विकसित किया है. इन न्यूरॉन्स आगे के लिए बनाए रखा जा सकता है 30 दिनों के रखरखाव माध्यम हर 3 दिन और अधिक जटिल न्यूरॉन नेटवर्क के विकास के साथ बदलकर. चित्रा 3 बीमें ,सी, इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए न्यूरोनल मार्कर तुज1 (विभेदित न्यूरॉन्स का एक मार्कर)21 और ताऊ (एक्सॉन्स का एक मार्कर) 22 के साथ धुंधला द्वारा कम घनत्व संस्कृति न्यूरॉन्स के न्यूरोनल प्रकृति को प्रकट करने के लिए किया गया था , क्रमशः. चित्रा 3B में लाल रंग तुज1 धुंधला की उपस्थिति को इंगित करता है, और चित्रा 3C में हरे प्राथमिक न्यूरॉन्स के axons में धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है. तंत्रिकाक संस्कृति की शुद्धता एस्ट्रोसाइट्स के GFAP के लिए गैर-न्यूरोनल मार्करों के दाग के अभाव के द्वारा दिखाया गया है (चित्र 3 डी) और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स के O4 ( चित्र3E) . नीले रंग में दिखाया नाभिक Hoechst 33258 के साथ दाग थे.
7 दिनों के बाद उच्च घनत्व प्लेटेड न्यूरॉन्स सहज तंत्रिकामंडलों के गठन से चिह्नित होते हैं , जैसा कि चित्र 4ए,बी,सी,डीमें देखा गया है . 8-10 दिनों के बाद, न्यूरोस्फीयरों के बीच रेडियल ग्लिल जैसे विस्तार ों वाले अलग-अलग पुलों को देखा गया, जैसा कि चित्र 4Eमें देखा गया है। neurospheres भरपूर NPCs, जो coexpress मार्करने Nestin और Tuz123के साथ संपन्न थे. न्यूरोस्पेहेअर्स नेस्टिन और तुज के सकारात्मक दाग दिखाते हैं, जैसा कि चित्र 524में दिखाया गया है। नीले रंग में दिखाया नाभिक Hoechst 33258 के साथ दाग था. इन neurospheres अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में उन्हें culturing द्वारा कई हफ्तों के लिए बनाए रखा जा सकता है. चित्रा 6में, लगभग 30 दिनों के लिए सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की लंबी उम्र का मूल्यांकन किया गया था, और सेल व्यवहार्यता पारंपरिक एमटीटी का उपयोग कर $ 5 दिनों के अंतराल पर मापा गया था [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli ब्रोमाइड] परख, जिसमें यह था पाया गया कि न्यूरॉन्स संस्कृति के 30 दिनों के बाद भी 90% से अधिक व्यवहार्यता से पता चला.
इसके बाद, उच्च और निम्न घनत्व वाली वरीयता प्राप्त संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स का प्रतिशत आंका गया। चूंकि इस पद्धति को मुख्य रूप से न्यूरॉन्स culturing के उद्देश्य से है, यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण था कि क्या इस विधि गैर-न्यूरॉन कोशिकाओं पर न्यूरॉन्स के अधिमानी विकास का समर्थन करता है, विशेष रूप से astrocytes. एस्ट्रोसाइट्स की आबादी की उपस्थिति neurosphere बनाने उच्च घनत्व वरीयता प्राप्त संस्कृति में मनाया गया, चित्रा 7Aमें GFAP धुंधला के हरे रंग से चिह्नित; हालांकि, काफी कम Tuz1 (लाल) की तुलना में मनाया गया था-सना हुआ न्यूरॉन आबादी. चित्र 7खमें मात्रात्मक आंकड़ों द्वारा इसकी भी पुन पुष्टि की गई थी, जिसमें तुज1 में जनसंख्या के 83% की तुलना में कोशिकाओं की जनसंख्या की संख्या 17% थी।
astrocytic जनसंख्या भी GFAP धुंधला के माध्यम से जांच की थी, न्यूरॉन जनसंख्या की तुलना में (Tuz1 धुंधला) कम घनत्व वरीयता प्राप्त कोशिकाओं में, के लिए 7 निरंतर दिनों. हालांकि कुल सेल संख्या में एक महत्वपूर्ण अंतर 7 दिनों के दौरान नहीं देखा गया था, कम बोने के कारण, astrocyte आबादी भी बहुत कम होना देखा गया था (लगभग कोई या बहुत कम GFAP धुंधला), बहुमत के साथ न्यूरॉन आबादी जा रहा है (बहुत उच्च तुज1 अभिव्यक्ति) के रूप में चित्र 8Aमें मनाया |
जैसा कि चित्र 8खमें दर्शाया गया है, सेलसेन्स सॉफ्टवेयर की सहायता से माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स की जनसंख्या की गणना करके मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था, जिसमें एस्ट्रोसाइट जनसंख्या का केवल 2%-3% ही देखा गया था। उपयुक्त मीडिया और पोषक तत्वों की कमी के कारण इसके विकास का समर्थन करने के लिए, astrocytes की यह आबादी भी धीरे धीरे समय के साथ नष्ट हो गया, जबकि इष्टतम कारकों और मीडिया की उपस्थिति में, न्यूरॉन्स तेजी से पूरी संस्कृति पर ले लिया.
चित्र 9में दिखाया गया है, यह देखा गया है कि NPCs की उपस्थिति के कारण, neurospheres भी एस्ट्रोसाइट्स की उच्च मात्रा व्यक्त की, GFAP के मजबूत हरी संकेत द्वारा चिह्नित एक मजबूत Tuz1 संकेत के साथ धुंधला. अंत में, निरीक्षण करने के लिए कि क्या इन neurospheres समय के साथ विस्तार, उच्च घनत्व संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद, जिस पर बिंदु छोटे neurospheres के रूप में शुरू कर दिया, कुछ अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में स्थानांतरित कर रहे थे और उनके विकास के लिए हर 5 दिनों की निगरानी की गई थी अप करने के लिए 15 दिन.
कोशिकाओं के स्वास्थ्य की जांच करने के लिए कैल्सिन एएम (हरा) और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) का उपयोग करके एक जीवित/मृत कोशिका परख भी की गई थी। यह देखा गया कि विस्तार neurospheres कोई लाल दाग के साथ हरी फ्लोरोसेंट की एक बड़ी राशि से पता चला, संस्कृति में कम से कम 15 दिनों के लिए neurospheres में होने वाली कोई मौत का संकेत, चित्र 10Aमें प्रस्तुत के रूप में . जैसा कि चित्र 10खमें दर्शाया गया है, 15 दिनों तक संस्कृति में प्रत्येक 5 दिनों में neurospheres का विशाल विस्तार देखा गया. neurospheres की मात्रा में अंतिम वृद्धि का प्रतिनिधित्व लाइन ग्राफ साजिश करने के लिए (प्रत्येक timepoint के लिए), 50 neurospheres का अध्ययन किया गया, और उनके औसत प्रत्येक समय बिंदु पर neurosphere मात्रा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
चित्र 1 : चढ़ाना के 4 एच के बाद सेल पालन का प्रतिनिधित्व। (ए) उच्च घनत्व में कोशिका पालन चढ़ाया न्यूरॉन्स. (बी) कम घनत्व में कोशिका पालन चढ़ाया न्यूरॉन्स. स्केल बार (A,B) 200 डिग्री है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : चढ़ाना के 24 एच के बाद न्यूरॉन्स की कोशिका आकारिकी। (ए) उच्च घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स की कोशिका आकृति विज्ञान. (बी) कम घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स की कोशिका आकारिकी. स्केल बार्स (A, B) 20 m का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : Morphology और कम घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स की विशेषता 7 दिनों के बाद. (क) व्यापक अंकुरित होने वाले न्यूरॉन्स की चरण-विपरीत छवि। स्केल बार 200 m. ओवरले छवियों को न्यूरोनल प्रोटीन(बी) तुज1 (लाल) और (सी ) ताऊ (हरा) के लिए अभिव्यक्ति दिखा प्रतिनिधित्व करता है। प्रतिरक्षा विज्ञान स्पष्ट रूप से गैर-न्यूरोनल प्रोटीन में धुंधला की अनुपस्थिति दिखा (डी) GFAP (हरा) और (ई) O4 (लाल). Nuclei Hoechst 33258 (नीले) के साथ दाग रहे थे. स्केल बार ्स्स इन (बी, सी, डी, ई) 20 डिग्री सेल्सियस का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : उच्च घनत्व में neurospheres के गठन 7 दिनों के बाद न्यूरॉन्स चढ़ाया. (ए-डी) सहज उच्च घनत्व चढ़ाया न्यूरॉन्स से संस्कृति में 7 दिनों के बाद neurospheres उत्पन्न. (म) काले तीरों द्वारा दर्शाए गए दो नवगठित तंत्रिकामंडलों के बीच रेडियल ग्लिल-जैसे विस्तारका का निर्माण। स्केल बार ्स्स इन (A, B, C, D, E) 200 m का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : प्राप्त neurospheres की विशेषता. न्यूरोस्फीयरों की ओवरले छवि जो न्यूरोनलप्रोटीन तुज1 (लाल ) और तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर नेस्टिन (हरा) के लिए अभिव्यक्ति दिखा रही है, जो एनपीसी समृद्ध आबादी का संकेत देती है। न्यूक्लीकेस Hoechst 33258 (नीले) के साथ दाग रहेथे. स्केल बार 20 डिग्री मी का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : प्राथमिक न्यूरॉन्स की कोशिका व्यवहार्यता. बार ग्राफ प्राथमिक न्यूरॉन्स की सेल व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करता है, 5 दिनों के अंतराल पर 30 दिनों के लिए एक MTT परख का उपयोग कर मूल्यांकन. त्रुटि पट्टी SD मान का प्रतिनिधित्व करता है (*p और lt; 0.05). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7 : न्यूरोस्फीयर की विशेषता न्यूरोल मार्कर तुज1 और एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP के साथ उच्च घनत्व संस्कृतियों के गठन। (ए) छवि उच्च घनत्व वरीयता प्राप्त कोशिकाओं (डीआईसी मोड में) से पता चलता है, जो neuropsheres उत्पन्न करता है दोनों GFAP व्यक्त (एस्ट्रोसाइट्स के लिए) और तुज1 (न्यूरॉन्स के लिए). Nuclei Hoechst 33258 के साथ दाग रहे थे. स्केल बार 20 डिग्री मी. (बी) बार ग्राफ का प्रतिनिधित्व करता है, जो उच्च घनत्व कोशिकाओं को उत्पन्न करने वाले तंत्रिकामंडल में तुज1-प्रत्याह्वेषण कोशिकाओं और GFAP-expressing कोशिकाओं की जनसंख्या के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टी SD (*p]lt; 0.05) का प्रतिनिधित्व करती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8 : न्यूरोनल मार्कर तुज1 और एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP लगातार 7 दिनों तक के साथ प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति के लिए कम घनत्व चढ़ाया कोशिकाओं की विशेषता. (A) छवि चार अलग अलग चैनलों में कम घनत्व वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से पता चलता है (यानी, डीआईसी, नीले चैनल [होचस्ट 33258 द्वारा परमाणु धुंधला इंगित करता है], हरी चैनल [GFAP धुंधला], और लाल चैनल [के लिए Tuj1 धुंधला]) लगातार 7 दिनों के लिए. स्केल बार 20 डिग्री मी का प्रतिनिधित्व करता है (ख) बार ग्राफ 7 दिनों के लिए प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति के लिए कम घनत्व वाले बीज कोशिकाओं में GFAP-expressing कोशिकाओं की संख्या के लिए तुज1-प्रत्याद कोशिकाओं की आबादी के प्रतिशत अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टी SD (*p]lt; 0.05) का प्रतिनिधित्व करती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 9 : GFAP और तुज1 के साथ प्राप्त neurospheres के इम्यूनोस्टेनिंग. प्राप्त neurospheres की छवियाँ हैं (ए) DIC मोड में, (बी) नाभिक धुंधला Hoechst 33258 का उपयोग कर, (सी) एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP (हरा), और (डी) न्यूरॉन मार्कर Tuz1 (लाल). स्केल बार 20 डिग्री मी का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 10 : 15 दिनों से अधिक neurospheres के विकास और लाइव / मृत सेल परख. (ए) छवि डीआईसी मोड में 5 दिन के अंतराल पर 15 दिनों से अधिक एक neurosphere के विकास से पता चलता है, साथ ही कैलसीएन AM के साथ अपने दाग (हरी लाइव कोशिकाओं को इंगित करता है) और पीआई (एक लाल रंग के साथ propidium आयोडाइड मृत कोशिकाओं को इंगित करता है). स्केल बार 20 डिग्री मी. (बी) ग्राफ 5 दिन के अंतराल पर 15 दिनों की अवधि में कम पालन प्लेटों में उगाए गए neurospheres के आकार में वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है. SD का प्रतिनिधित्व करता है त्रुटि पट्टी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे प्राथमिक न्यूरॉन्स की कोशिका चढ़ाना घनत्व बदलने से, दो चर न्यूरॉन प्लेटफार्मों प्राप्त कर रहे हैं. हालांकि यह एक सरल विधि है, प्रत्येक कदम सावधानी से वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए. अन्य पिछले तरीकों या तो लंबी अवधि के प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों या neurosphere संस्कृतियों की सूचना दी है. सबसे प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति प्रोटोकॉल 3-5 सप्ताह के लिए हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की खेती शामिल है, लेकिन सबसे विफल रहे हैं, न्यूरॉन्स मर जाते हैं और कनेक्शन के नुकसान के कारण दूर मुरझा के रूप में. प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि न्यूरॉन्स किसी भी glial फीडर परत के लिए आवश्यकता के बिना सुसंस्कृत किया जा सकता है, इसलिए न्यूरॉन्स की शुद्धता को बनाए रखने.
हालांकि, कई महत्वपूर्ण चरणों सावधानी से इच्छित परिणाम प्राप्त करने के लिए पालन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, भर में बाँझ शर्तों को बनाए रखने बिल्कुल आवश्यक है. यह शुरू करने से पहले 70% शराब के साथ एक laminar हुड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूर्व साफ सभी स्लैब, उपकरणों, और शल्य चिकित्सा उपकरणों में सबसे अधिक कदम प्रदर्शन करने की सलाह दी है; अन्यथा, बैक्टीरिया और कवक द्वारा संदूषण के कारण विफलता की अधिक संभावना है। अगले, यह E14-16 भ्रूण को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है; इसलिए, योनि प्लग का पता लगाने कदम ध्यान से प्रदर्शन किया जाना चाहिए. जैसे-जैसे भ्रूण दिवस बढ़ता है, गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं द्वारा संदूषण की संभावना अधिक होती है। गोलार्द्धों से मेनिंग्स को पूर्ण रूप से हटाने गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं द्वारा संस्कृति में हस्तक्षेप को कम करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। हर घटक एक आवश्यक भूमिका निभाता है के रूप में चढ़ाना और रखरखाव माध्यम दोनों, सभी घटकों के साथ ताजा तैयार किया जाना चाहिए। एक और पहलू है कि मन में रखा जाना चाहिए है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स प्राप्त रखरखाव मध्यम 2x प्रति सप्ताह बदलकर बनाए रखा जाना चाहिए ताकि proliferating न्यूरॉन्स के लिए पोषक तत्व की आपूर्ति स्थिर रहता है.
हालांकि यह अभी तक प्रयास नहीं किया गया है, मामूली संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल भी माउस भ्रूण न्यूरॉन्स में उपयोगी हो सकता है. यदि वांछित न्यूरॉन्स या neurospheres इस तकनीक का पालन प्राप्त नहीं कर रहे हैं, वहाँ कुछ समस्या निवारण युक्तियाँ है कि सहायक हो सकता है. ऊतकों को व्यवहार्य रखने के लिए, विच्छेदन बर्फ ठंडा HBSS में किया जाना चाहिए. विच्छेदन भी HBSS बफ़र के बजाय बर्फ-ठंडा Krebs बफ़र में किया जा सकता है। जल्दी विच्छेदन प्रदर्शन ऊतक व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. 10x trypsin का उपयोग ऊतक के अतिअप करने के लिए नेतृत्व करेंगे. इसलिए, पाचन से पहले वियोजन बफर में 1x करने के लिए पतला किया जाना चाहिए 10x trypsin-EDTA समाधान. कोशिकाओं के लिए बर्फ ठंडा माध्यम के अलावा, फ्रीज-शॉक को प्रेरित करने, हर कीमत पर बचा जाना चाहिए, और आरटी तक पहुंचने के बाद माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, coverslips हमेशा PDL के साथ लेपित किया जाना चाहिए, अन्यथा न्यूरॉन्स coverslips करने के लिए संलग्न नहीं होगा. Trituration कदम प्रदर्शन करते समय किसी भी कठिनाई के मामले में (यानी, ऊतक ठीक से पचा नहीं), पाचन 10 मिनट के लिए 1% DNase के 0.5 एमएल जोड़कर किया जा सकता है. यदि गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं द्वारा संदूषण के उच्च डिग्री का सामना करना पड़ता है, तो गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के विकास को रोकने के लिए $ 5 $M साइटोसिन राराइनोसाइड (एआरसी) जोड़ा जाना चाहिए।
इसके कई फायदे के बावजूद, इस तकनीक को कुछ सीमाओं से ग्रस्त है. यह ज्ञात है कि इस तकनीक स्वतः neurospheres उत्पन्न करता है (हालांकि, ट्रिगर आणविक तंत्र ज्ञात नहीं हैं); हालांकि, इस तकनीक के बारे में कुछ अस्पष्टता बनी हुई है, जैसे neurospheres का सही आकार और neurospheres की पर्याप्त संख्या बनाने के लिए आवश्यक दिनों की सही संख्या. ज्यादातर, आकार समस्या है. हालांकि यह देखा गया है कि neurospheres समय के साथ मात्रा में विस्तार, प्रारंभिक neurospheres प्राप्त चर आकार के हैं. हालांकि उपयोगी है, यह एक सिंक्रनाइज़ अध्ययन करने के लिए मुश्किल बनाता है। क्या दूसरों से इस neurosphere पीढ़ी प्रोटोकॉल अलग अपनी मजबूती और सादगी है. वहाँ पहले विशेष मध्यम आवश्यकताओं और संस्कृति की स्थिति की आवश्यकता होती है neuropheres के culturing और प्रचार के लिए प्रोटोकॉल की सूचना दी है, जिनमें से कोई भी इस प्रोटोकॉल में आवश्यक है. इन पहले की सूचना प्रोटोकॉल में, वहाँ शायद ही neurospheres उत्पन्न करने के लिए देख रहे लोगों के लिए कोई एकरूपता है.
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल बस E14-E16 Sprague Dawley चूहों के भ्रूण से अलग प्राथमिक न्यूरॉन्स के सेल चढ़ाना घनत्व बदलने से दोनों 2 डी और 3 डी न्यूरॉन प्लेटफार्मों की पीढ़ी के लिए एक अद्वितीय रणनीति का वर्णन करता है. यह विधि अन्य विधियों की तुलना में लागत प्रभावी है, क्योंकि यह एक साधारण सेट-अप के साथ किया जा सकता है और बहुत कम अभिकर्मकों और चरणों की आवश्यकता होती है। यह neuroscientists के लिए ब्याज के विभिन्न अनुप्रयोगों प्रदान कर सकते हैं. यह विभिन्न न्यूरो-चिकित्सा सुराग के लिए स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, विभिन्न न्यूरॉन कार्गो प्रोटीन की भूमिकाओं को देख, कई neurodegenerative रोगों में सेलुलर रास्ते की जांच, और कई अन्य अनुप्रयोगों. न्यूरोस्फीयरों का उपयोग विभिन्न तंत्रिका विभेदक एजेंटों की स्क्रीनिंग और विट्रो25,26में तंत्रिका विकास की प्रारंभिक अवस्थाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है .
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.
Acknowledgments
हम सीएसआईआर-आईसीबी पशु सुविधा का धन्यवाद करते हैं। जी.डी. धन्यवाद आईसीएमआर, जे के और वी जी धन्यवाद डीएसटी प्रेरणा, और डी एम धन्यवाद डीबीटी, भारत उनकी फैलोशिप के लिए। एस जी कृपया वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए एसईआरबी (ईएमआर/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
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