Inducerende meningokokken meningitis serogroep C in muizen via Intracisternal Delivery
Summary
Hier beschrijven we een methode om meningokokken meningitis te induceren via een intracisternale infectie route bij volwassen muizen. We presenteren een stap voor stap Protocol van meningokokkeninfectie van de bereiding van entmateriaal tot de intracisternale infectie; Noteer vervolgens de overleving van het dier en evalueer de bacteriële ladingen in muriene weefsels.
Abstract
Neisseria meningitidis (Meningococcus) is een micro-organisme met een smal hostbereik, wereldwijd erkend als de belangrijkste oorzaak van bacteriële meningitis. Meningokokken is een voorbijgaande kolonisator van humane Nasofarynx van ongeveer 10% van het gezonde onderwerp. In bijzondere omstandigheden, het krijgt een invasieve vermogen om te penetreren de mucosale barrière en binnenvalt de bloedbaan veroorzaakt septikemie. In het laatste geval kan fulminating sepsis ontstaan, zelfs zonder de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van meningitis. Omgekeerd, bacteriën kunnen slecht vermenigvuldigen in de bloedbaan, kruis de bloed-hersen barrière, bereiken het centrale zenuwstelsel, leidt tot fulminante meningitis. De Murine modellen van bacteriële meningitis vertegenwoordigen een nuttig instrument om te onderzoeken van de gastheer-pathogen interacties en voor het analyseren van de pathogenetische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze dodelijke ziekte. Hoewel verschillende experimentele modelsystemen in de afgelopen decennia zijn geëvalueerd, waren geen van deze in staat om de karakteristieke pathologische gebeurtenissen van Meningokokkenziekte te reproduceren. In dit experimentele protocol beschrijven we een gedetailleerde procedure voor de inductie van meningokokken meningitis in een muismodel op basis van de intracisternale inoculatie van bacteriën. De bijzondere tekenen van menselijke meningitis werden geregistreerd in de Murine gastheer door de beoordeling van klinische parameters (bv. temperatuur, lichaamsgewicht), evaluatie van overlevingskansen, microbiologische analyse en histologisch onderzoek van hersenletsel. Bij gebruik van intracisternal (i. CIST.) entmateriaal, meningokokken complete levering rechtstreeks in Cisterna magna, wat leidt tot een zeer efficiënte meningokokken replicatie in het hersenweefsel. Een 1.000-voudige toename van levensvatbare telling van bacteriën wordt waargenomen bij ongeveer 18 uur. Bovendien worden meningokokken ook aangetroffen in de milt en de lever van geïnfecteerde muizen, wat suggereert dat de lever een doelorgaan voor meningokokken replicatie kan vertegenwoordigen.
Introduction
Neisseria meningitidis is een gram negatief β-proteobacterium beperkt tot de menselijke gastheer, bekend als een van de meest voorkomende oorzaken van meningitis en sepsis in de menselijke populatie over de hele wereld. Het koloniseert de bovenste luchtwegen (neus en keel) van gezonde en asymptomatische dragers (2-30% van de bevolking), maar de bacterie ontwijkt soms verschillende gastheer immuun afweer en verspreidt zich van de bloedbaan naar de hersenen waardoor een ongecontroleerde lokale ontsteking, bekend als meningokokken meningitis. Een combinatie van host-en bacteriële factoren lijkt bij te dragen aan de overgang van de commensaal naar het invasieve gedrag1.
N. meningitidis is uitsluitend gespecialiseerd in menselijke kolonisatie en infectie. Het heeft een smal ontvangstbereik en heeft daarom beperkte in vivo pathogenese studies als gevolg van het ontbreken van geschikte diermodellen die de menselijke Meningokokkenziekte reproduceren. Dientengevolge, het had geleid tot fundamentele lacunes in het begrip met betrekking tot de pathogenese van septicemie en meningitis veroorzaakt door meningokokken. In de laatste decennia, de ontwikkeling van veel in vitro systemen toegestaan de identificatie van verschillende meningokokken virulentie factoren2,3,4. Hoewel deze waardevolle studies belangrijke inzichten hebben verschaft om de rol van deze factoren voor een succesvolle meningokokkeninfectie te begrijpen, konden deze modellen geen beoordeling geven van de gevolgen van bacteriële interacties met de humorale en cellulaire immuunsysteem en nog minder met het hele weefsel. In vivo diermodellen van infectie zijn ook van groot belang voor de evaluatie van de beschermingsgraad die wordt toegekend door vaccinformuleringen. Als humaan-Tropic pathogeen bezitten meningokokken geschikte determinanten die nodig zijn voor een succesvolle infectie, zoals Oppervlaktestructuren (d.w.z. type IV pili en opaciteits eiwitten) en ijzeropname systemen voor menselijke receptoren en transporteiwitten (d.w.z. transferrine en lactoferrine)5,6,7 om goed te hechten, te overleven en de menselijke gastheer binnen te vallen. Tot slot dragen de genetische variatie capaciteiten van de pathogeen bij tot het ontwijken en/of blokkeren van de menselijke immuunrespons verder bij aan het hoge soort tropisme8,9. Daarom kan de afwezigheid van specifieke gastheerfactoren, die betrokken zijn bij de interactie, stappen van de levenscyclus van het pathogeen blokkeren, waardoor aanzienlijke moeilijkheden ontstaan bij de ontwikkeling van kleine diermodellen met een samenvatting van de meningokokken levenscyclus.
In de afgelopen decennia zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om ons begrip van de meningokokken infectieuze cyclus te verbeteren. Infecties van twee diermodellen, muizen en ratten, ofwel intraperitoneaal (i.p.) of intra lateraal (i.n.), werden ontwikkeld om Meningokokkenziekte te reproduceren10,11,12,13,14 ,15,16,17. De laboratorium muis is waarschijnlijk een van de veelzijdiger dieren voor het induceren van experimentele meningokokkeninfectie.
Echter, de i.p. manier van infectie leidt tot de ontwikkeling van ernstige sepsis, hoewel het niet de natuurlijke route van de infectie nabootsen, terwijl de i.n. infectie route nuttig was om meningokokken pathogenese te evalueren, hoewel het longinfectie kan induceren vóór sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
Het i.p. muismodel was een belangrijke rol om de bescherming tegen de meningokokken Challenge10,11,12te beoordelen. Het muismodel van meningokokken kolonisatie op basis van de i.n. besmettingsroute is ontwikkeld met zuigelingen muizen, omdat ze gevoeliger zijn voor meningokokken, om een invasieve infectie te reproduceren die het beloop van de Meningokokkenziekte bij mensen nabootsen 13,14,15,16,17. Bovendien werd, ter bevordering van meningokokken replicatie in de Murine-gastheer, ook een groeiend aantal technische strategieën toegepast, waaronder de toediening van het ijzer aan de dieren om de infectie te verbeteren, het gebruik van hoog bacterieel entmateriaal, muis-doorgang bacteriestam evenals de tewerkstelling van zuigeling of immuungecompromitteerde dieren hosts10,13,15,18,19. De expressie van specifieke menselijke factoren zoals CD4620 of transferrine21 heeft de gevoeligheid van muizen voor deze humane-trope bacterie verhoogd; de tewerkstelling van het xenotransplantaatmodellen is-infectie model van de menselijke huid is ook nuttig geweest om de wrijvings capaciteit van meningokokken te evalueren op humaan endotheel22,23. Gezamenlijk heeft de recente ontwikkeling van gehumaniseerde transgene muizen het begrip van de meningokokken pathogenese en de interacties van de gastheer verbeterd.
Eerder ontwikkelden we een muriene model van meningokokken meningitis waarbij de inoculatie van bacteriën werd uitgevoerd in de Cisterna magna van volwassen muizen met muis-doorgangen van bacteriën24. Klinische parameters en de overlevingskans van geïnfecteerde muizen toonden de oprichting van meningitis met kenmerken vergelijkbaar met die gezien in de menselijke gastheer, evenals, de microbiologische en histologische analyses van de hersenen. Uit deze geïnfecteerde muizen, bacteriën waren, ook, teruggewonnen uit bloed, lever, en milt, en bacteriële ladingen van perifere organen gecorreleerd met de infectieuze dosis. In het bijzonder werd dit model gebruikt om de virulentie van een isogene Mutant stam defect in de L-glutamaattransporter GltT24te evalueren. Onlangs, met behulp van onze muismodel van meningokokken meningitis op basis van i. CIST. route met serogroep C stam 93/42862,24 en een isogene Mutant defect in cssa gen codering voor UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, hebben we de rol van blootgestelde sialuzuur geanalyseerd in de inrichting van de ziekte bij muizen.
In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om experimentele meningokokken meningitis te induceren op basis van de i. CIST. infectie route in Balb/c volwassen muizen. Deze methode is met name nuttig voor de karakterisering van meningokokkeninfectie in een muriene gastheer, evenals voor de beoordeling van de virulentie tussen wild type referentie stammen en isogene mutanten. De intra-cisterne-infectie route zorgt voor een volledige levering van het meningokokken rechtstreeks in de Cisterna magna, die op zijn beurt de bacteriële replicatie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) vergemakkelijkt en meningitis induceert met functies die die nabootsen aanwezig bij de mens2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we een experimenteel protocol voor het opwekken van meningokokken meningitis bij volwassen muizen door i. CIST. inoculatie van meningokokken bacteriën. Voor onze kennis is er geen ander model van meningokokken meningitis ontwikkeld in laboratorium muizen geïnfecteerd door i. CIST. route in het verleden is deze manier onderzocht om modellen van meningokokken meningitis te leveren in zowel rat31 als konijn32. Het is bekend dat de hoogste graad van…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studies werden deels ondersteund door PRIN 2012 [subsidie nummer 2012WJSX8K]: “host-microbe interaction modellen in mucosale infecties: ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën” en door PRIN 2017 [2017SFBFER]: “een geïntegreerde aanpak om de wisselwerking tussen aanpassing, stressvolle omstandigheden en antimicrobiële resistentie van uitdagende pathogenen “.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Referências
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 – Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
