גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לגרום דלקת קרום הגרון דרך מסלול הזיהום התאיים בעכברים למבוגרים. אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול של דלקת קרום הגרון מתוך הכנת האיסיס לזיהום התאיים; לאחר מכן להקליט את ההישרדות בעלי חיים ולהעריך את העומסים חיידקי ברקמות murine.
Abstract
מנינגוקוקוס הוא מיקרואורגניזם בטווח הצר, המזוהה באופן גלובלי כגורם המוביל לדלקת קרום הגרון החיידקית. מנינגוקוקוס הוא הקולוניאליסט ארעי של האף האנושי האדם של כ 10% של נושא בריא. בנסיבות מסוימות, היא מקבלת יכולת פולשנית לחדור אל מכשול המוקוסל ופולשת למחזור הדם הגורם לספטיתרמיה. במקרה האחרון, אלח דם שתוללת יכול להיווצר גם ללא ההתפתחות הסוגר של דלקת קרום המוח. לעומת זאת, חיידקים יכולים להתרבות בצורה גרועה במחזור הדם, לחצות את מכשול המוח בדם, להגיע למערכת העצבים המרכזית, המובילה לדלקת קרום הדם הרועמת. מודלים murine של דלקת הקרום החיידקי מייצגים כלי שימושי כדי לחקור את האינטראקציות המארחים הפתוגן ולנתח את המנגנונים הפתוגנטיים האחראים למחלה קטלנית זו. למרות, מספר מערכות מודל ניסיוני הוערכו בעשורים האחרונים, אף אחד מהם לא הצליחו לשחזר את האירועים הפתולוגיים האופייניים של מחלת קרום הגרון. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו מתארים הליך מפורט עבור אינדוקציה של דלקת קרום הגרון במודל העכבר מבוסס על החיסון התאיים של חיידקים. הסימנים השונים של דלקת קרום המוח האנושי נרשמו במארח murine באמצעות הערכה של פרמטרים קליניים (למשל, טמפרטורה, משקל הגוף), הערכה של שיעור ההישרדות, ניתוח מיקרוביולוגית ובדיקה היסטולוגית של פגיעה מוחית. בעת שימוש ב-תאיים (i. ושכב.), מסירה מלאה לגמרי ישירות לתוך cisterna מגנה, המובילה לשכפול מאוד יעיל של קרום המוח ברקמת המח. גידול 1,000 מקפלים של ספירה קיימא של חיידקים הוא נצפתה כ 18 h. יתר על כן, מניגוקוצ’י נמצאים גם בטחול, ובכבד של עכברים נגועים, הרומז כי הכבד עשוי לייצג איבר יעד עבור שכפול קרום הגרון.
Introduction
מנינגקוקוס היא β שלילית-פרוטקוביום מוגבל לפונדקאי האנושי, ידוע בהיותו אחד הגורמים השכיחים ביותר של דלקת קרום הגוף ואלח דם באוכלוסייה האנושית ברחבי העולם. הוא מקולוניא את מערכת הנשימה העליונה (האף והגרון) של נשאים בריאים ואסימפטומטיים (2-30% מהאוכלוסייה), אבל החיידק מתחמק לפעמים שונים הגנות החיסון העצמי מתפשט ממחזור הדם למוח גרימת מקומי בלתי מבוקרת דלקת, הידועה בשם. דלקת קרום הגרון שילוב של גורמים מארחים וחיידקיים מופיע כדי לתרום את המעבר מן הקומנדציה להתנהגות פולשנית1.
(ש ע) מנינגטידיס , מתמחה באופן בלעדי בקולוניזציה אנושית וזיהום. יש לו טווח מארח צר, ולכן, יש מוגבל במחקרים vivo בפתוגנזה בשל העדר מודלים בעלי חיים מתאימים השעתקים מחלת הקרום האנושי. כתוצאה מכך, היא הובילה לפערים בסיסיים בהבנת הפתוגנזה של ספטטימיה ודלקת קרום הגרון שנגרמו מחיידק הקרום. בעשורים האחרונים, התפתחות של מערכות מבחנה רבות אפשרה זיהוי של מספר גורמים התקפה אלימה של הקרום2,3,4. למרות מחקרים יקרי ערך אלה סיפקו תובנות חשובות כדי להבין את התפקיד של גורמים אלה עבור זיהום קרום הגרון מוצלח, מודלים אלה לא אפשרו הערכה של ההשלכות של אינטראקציות חיידקי עם המוסר והסלולר מערכת החיסונית ואפילו פחות עם הרקמה כולה. במודלים של בעלי חיים vivo של זיהום הם בעלי רלוונטיות רבה גם עבור הערכה של תואר הגנה הענקת על ידי ניסוחים החיסון. כפתוגן אנושי-טרופי, מנינגוקוקוס בעלי דטרמיניזם מתאים הכרחי לזיהום מוצלח כגון מבני פני השטח (כלומר, הקלד IV והאטימות חלבונים) ומערכות ספיגה ברזל עבור קולטנים אנושיים וחלבונים הובלה (כלומר, transferrin ו-lactoferrin)5,6,7 כדי לדבוק כראוי, לשרוד ולפלוש הפונדקאי האנושי. לבסוף, את היכולות הגנטיות וריאציה של הפתוגן להתחמק ו/או לחסום את התגובה החיסונית האנושית עוד לתרום הזנים הגבוהים tropism8,9. לכן, העדר גורמים מארחים מסוימים, המעורבים באינטראקציה, יכולים לחסום את הצעדים של מחזור החיים של הפתוגן, הקמת קשיים משמעותיים בפיתוח של מודלים בעלי חיים קטנים המסכמים את מחזור החיים של קרום הגרון.
במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר גישות כדי לשפר את הבנתנו את המחזור הזיהומיות של קרום הגרון. זיהומים של שני דגם בעלי חיים, עכבר ועכברוש, או intraperitoneally (כיתה) או intranasally (i.n.), פותחו כדי לשחזר את מחלת קרום הגרון10,11,12,13,14 ,15,16,17. עכבר המעבדה הוא כנראה אחד החיות תכליתי יותר עבור גרימת זיהום קרום הגרון ניסיוני.
עם זאת, הדרך הקומתי של זיהום מוביל להתפתחות של אלח דם חמורים למרות שהוא לא לחקות את התוואי הטבעי של זיהום, בעוד התוואי i.n. של זיהום היה שימושי כדי להעריך פתוגנזה מעיים, למרות שזה עלול לגרום לדלקת ריאות לפני אלח דם10,11,12,13,14,15,16,17.
מודל העכבר כאיי היה אינסטרומנטלי להעריך את ההגנה מפני האתגר של קרום הגרון10,11,12. מודל העכבר של הקולוניזציה מחלת הקרום מבוסס על תוואי i.n. של זיהום פותחה עם עכברים התינוק, כפי שהם רגישים יותר קרום הגרון, כדי לשכפל זיהום פולשני מחקה את הקורס של מחלת קרום הגרון בבני אדם 13,14,15,16,17. יתר על כן, כדי לקדם את שכפול קרום הגרון במארח murine, מספר גדל והולך של אסטרטגיות טכניות יושמו גם כולל את הניהול של הברזל לבעלי חיים כדי לשפר את הזיהום, השימוש בחיידקים גבוהים בקטריות, העכבר מאמץ חיידקי בקטריאלי, כמו גם את התעסוקה של התינוק או בעלי חיים מארחים חיסוני10,13,15,18,19. ביטוי של גורמים אנושיים ספציפיים כמו CD4620 או transferrin21 הגביר את הרגישות של עכברים לחיידק זה אנושי-טרופי; התעסוקה של העור האנושי מודל מבע של זיהום גם היה שימושי כדי להעריך את היכולת הדבקה של מניגוקוצ’י לאנדותל האנושי22,23. באופן קולקטיבי, ההתפתחות האחרונה של עכברים טרנסגניים הומניזציה שיפרה את ההבנה של הפתוגנזה קרום הגרון ואת האינטראקציות המארחות שלה.
בעבר, פיתחנו מודל murine של דלקת קרום הגרון שבו החיסונים של חיידקים בוצעה לתוך cisterna מגנה של עכברים מבוגרים עם העכבר-passaged חיידקים24. פרמטרים קליניים ושיעור ההישרדות של עכברים נגועים הפגינו הקמתה של דלקת קרום המוח עם מאפיינים הדומים לאלה שנראו בפונדקאי האנושי, כמו גם, ניתוח מיקרוביולוגי היסטולוגית של המוח. מן העכברים הנגועים האלה, החיידק היו, גם, התאושש דם, כבד, טחול, ו חיידקים עומסים של איברים היקפיים בקורלציה עם המינון זיהומיות. בפרט, מודל זה הועסק כדי להעריך את התקפה אלימה של זן מוטציה איזוגניים פגום ב-L-גלוטמט המשלח GltT24. לאחרונה, באמצעות מודל העכבר שלנו של קרום הגרון המבוסס על i. ושכב. המסלול עם קבוצת המיורית C זן 93/42862,24 ו מוטציה איזוגנית פגום בקידוד cssa ב-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, ניתחנו את התפקיד של חומצה סילית חשופה בהקמת של מחלות בעכברים.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ישירה כדי לגרום לדלקת קרום הגרון ניסויים בהתבסס על ה-i. ושכב. מסלול של זיהום בעכבר למבוגרים Balb/c. שיטה זו שימושית במיוחד לאפיון של זיהום קרום הגרון במארח מורכי, כמו גם להערכת התקפה אלימה בין מסוג פראי התייחסות זנים מוטציות איזוגניים. התוואי הפנים-cisternal של זיהום מבטיח משלוח שלם של קרום הגרון ישירות לתוך cisterna מגנה, אשר בתורו מקלה שכפול בקטריאלי בנוזל השדרה (שדרתי) ומעורר דלקת קרום הצורה עם תכונות המחקים אותם הנוכחים בבני אדם2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני לגרום דלקת קרום הגרון בעכברים למבוגרים על ידי i. ושכב. חיסון. של חיידקים מקרום הגרון לידיעתך, אין מודל אחר של קרום הגרון שפותחה בעכברי מעבדה נגועים על ידי i. ושכב. דרך בעבר, בדרך זו נחקרו כדי לספק מודלים של דלקת קרום הגרון בשני עכברוש31 ו ארנב<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקרים היו נתמכים בחלק על ידי מ2012 [מספר מענק 2012wjsx8k]: “מארח-חיידק אינטראקציה מודלים זיהומים רירית: פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות הרומן” ועל ידי מורה 2017 [2017sfbfer]: “גישה משולבת להתמודד עם הגומלין בין הסתגלות, תנאים מלחיצים ועמידות מיקרוביאלית של פתוגנים מאתגרים “.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Referências
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 – Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
