Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Summary

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Abstract

Neisseria meningitidis (meningococcus) é um microorganismo de alcance estreito, reconhecido mundialmente como a principal causa de meningite bacteriana. Meningococcus é um colonizador transitório da nasofaringe humana de aproximadamente 10% do sujeito saudável. Em circunstâncias particulares, adquire uma capacidade invasiva de penetrar na barreira da mucosa e invade a corrente sanguínea causando septicemia. No último caso, a sepse fulminante poderia surgir mesmo sem o consequente desenvolvimento da meningite. Por outro lado, as bactérias poderiam se multiplicar mal na corrente sanguínea, atravessar a barreira do cérebro sanguíneo, alcançar o sistema nervoso central, levando à meningite fulminante. Os modelos de urina de meningite bacteriana representam uma ferramenta útil para investigar as interações hospedógeno-patógeno e analisar os mecanismos pathogenéticos responsáveis por esta doença letal. Embora, vários sistemas de modelos experimentais tenham sido avaliados nas últimas décadas, nenhum deles foi capaz de reproduzir os eventos patológicos característicos da doença meningocócica. Neste protocolo experimental, descrevemos um procedimento detalhado para a indução da meningite meningocócica em um modelo de camundongo baseado na inoculação intracisternal de bactérias. Os sinais peculiares da meningite humana foram registrados no hospedeiro murina por meio da avaliação de parâmetros clínicos (por exemplo, temperatura, peso corporal), avaliação da taxa de sobrevida, análise microbiológica e exame histológico de lesão cerebral. Ao usar inóculo intracisternal (i.cist.), meningococos entrega completa diretamente em cisterna magna, levando a uma replicação meningocócica muito eficiente no tecido cerebral. Um aumento de 1.000 vezes da contagem viável de bactérias é observado em cerca de 18 h. Além disso, meningococos também são encontrados no baço, e fígado de camundongos infectados, sugerindo que o fígado pode representar um órgão-alvo para a replicação meningocócica.

Introduction

Neisseria meningitidis é um Gram negativo β-proteobacterium restrito ao hospedeiro humano, bem conhecido por ser uma das causas mais comuns de meningite e sepse na população humana em todo o mundo. Coloniza o trato respiratório superior (nariz e garganta) de portadores saudáveis e assintomáticos (2-30% da população), mas a bactéria às vezes evita várias defesas imunes do hospedeiro e se espalha da corrente sanguínea para o cérebro, causando um local descontrolado inflamação, conhecida como meningite meningocócica. Uma combinação de fatores do anfitrião e bacterianos parece contribuir à transição do commensal ao comportamento invasor^1.

N. meningitidis é especializada exclusivamente em colonização humana e infecção. Tem uma escala estreita do anfitrião e, conseqüentemente, limitou estudos in vivo do pathogenesis devido à falta dos modelos animais apropriados que reproduzem a doença meningocócica humana. Como resultado, levou a lacunas fundamentais na compreensão em relação à patogênese da septicemia e meningite causada pelo meningococcus. Nas últimas décadas, o desenvolvimento de muitos sistemas in vitro permitiu a identificação de vários fatores de virulência meningocócica^2,3,4. Embora esses estudos valiosos fornecessem insights importantes para entender o papel desses fatores para uma infecção meningocócica bem-sucedida, esses modelos não permitiram a avaliação das consequências das interações bacterianas com o humoral e celular sistema imunológico e ainda menos com todo o tecido. In vivo modelos animais de infecção são de grande relevância, bem como para a avaliação do grau de proteção conferida por formulações vacinais. Como patógeno humano-trópico, meningococcus possuem determinantes apropriados necessários para infecções bem-sucedidas, como estruturas superficiais (ou seja, pili tipo IV e proteínas de opacidade) e sistemas de captação de ferro para receptores humanos e proteínas de transporte (ou seja, transferrina e lactoferrina)^5,6,7 para aderir adequadamente, sobreviver e invadir o hospedeiro humano. Finalmente, as habilidades de variação genética do patógeno para fugir e/ou bloquear a resposta imune humana contribuem ainda mais para o tropotismo de espécies altas^8,9. Portanto, a ausência de fatores hospedeiros específicos, envolvidos na interação, pode bloquear etapas do ciclo de vida do patógeno, estabelecendo dificuldades significativas no desenvolvimento de pequenos modelos animais resumindo o ciclo de vida meningocócica.

Ao longo das últimas décadas, várias abordagens foram desenvolvidas para melhorar a nossa compreensão do ciclo infeccioso meningocócico. Infecções de dois modelos animais, camundongos e camundongos, intraperitoneally (i.p.) ou intranasally (i.n.), foram desenvolvidas para reproduzir a doença meningocócica^{10,11,12,13, 14 , 15,16,17.} O rato de laboratório é provavelmente um dos animais mais versáteis para induzir a infecção meningocócica experimental.

No entanto, a forma de infecção do i.p. leva ao desenvolvimento de sepse grave, embora não imite a via natural da infecção, enquanto a via de infecção do i.n. foi útil para avaliar a patogênese meningocócica, mesmo que possa induzir infecção pulmonar antes da sepse^{10,11,12,13,14,15,16,17.}

O modelo de mouse i.p. foi fundamental para avaliar a proteção contra o desafio meningocócico^10,11,12. O modelo do rato da colonização meningocócica baseada na rota i.n. da infecção foi desenvolvido com ratos infantis, porque são mais suscetíveis aos meningococci, para reproduzir uma infecção invasora que imita o curso da doença meningocócica nos seres humanos ^{13,14,15,16,17.} Além disso, para promover a replicação meningocócica no hospedeiro murine, um número crescente de estratégias técnicas também foram aplicadas, incluindo a administração do ferro para os animais para melhorar a infecção, o uso de alto inóculobacteriano , cepa bacteriana passagem por camundongos, bem como o emprego de animais infantis ou imunocomprometidos hospeda^{10,13,15,18,19}. A expressão de fatores humanos específicos como CD46²⁰ ou^{transferrin21} aumentou a susceptibilidade dos camundongos para esta bactéria humano-trópico; o emprego do modelo de xenoenxerto de pele humana de infecção também tem sido útil para avaliar a capacidade de adesão de meningococos ao endotelio humano^22,23. Coletivamente, o recente desenvolvimento de camundongos transgênicos humanizados melhorou a compreensão da patogênese meningocócica e suas interações hospedeiras.

Anteriormente, desenvolvemos um modelo de urina de meningite meningocócica, onde a inoculação de bactérias foi realizada na cisterna magna de camundongos adultos com bactérias de passagem de ratos²⁴. Parâmetros clínicos e a taxa de sobrevida de camundongos infectados demonstraram o estabelecimento de meningite com características comparáveis às observadas no hospedeiro humano, bem como as análises microbiológicas e histológicas do cérebro. Destes camundongos infectados, as bactérias foram, também, recuperados de sangue, fígado e baço, e cargas bacterianas de órgãos periféricos correlacionados com a dose infecciosa. Em particular, este modelo foi empregado para avaliar a virulência de uma cepa mutante isógênica com defeito no transportador L-glutamato GltT²⁴. Recentemente, usando nosso modelo do rato da meningite meningococcal baseada em i.cist. rota com cepa sorogrupo C 93/4286^2,24 e um mutante isogênico defeituoso na codificação de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase²⁵, analisamos o papel do ácido siálico exposto no estabelecimento de doença em camundongos.

Neste protocolo, descrevemos um método simples para induzir a meningite meningocócica experimental com base no i.cist. rota de infecção em camundongos adultos Balb/c. Este método é particularmente útil para a caracterização da infecção meningocócica em um hospedeiro de urina, bem como para a avaliação da virulência entre cepas de referência do tipo selvagem e mutantes isogênicos. A via intra-cisterna da infecção garante a entrega completa dos meningococos diretamente na cisterna magna, que por sua vez facilita a replicação bacteriana no líquido cefalorraquidiano (CSF) e induz meningite com características que imitam aqueles presente emseres humanos^2,24,25,26.

Protocol

Este protocolo foi conduzido para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de camundongos de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Experimentos in vivo relatados neste estudo foram aprovados pelo Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. número 2, 14 de dezembro de 2012) e pelo Ministério da Saúde italiano (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos os procedimentos devem ser realizados dentro do Gabinete de Biossegurança 2 (BSC2) em uma s…

Representative Results

Sobrevivência de camundongos infectados com N. meningitidis tipo selvagem e cepas mutantes isogênicos.As cepas Neisseria meningitidis utilizadas nestes resultados representativos são a estirpe de referência serogrupo C 93/4286 (ET-37) e o seu mutante isogênico 93/4286ΩcssA obtido por inativação insercional do gene cssA, codificação para o UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase, que mapeia na síntese cápsula locus25. Para avaliar o g…

Discussion

Neste estudo, descrevemos um protocolo experimental para induzir meningite meningocócica em camundongos adultos por i.cist. inoculação de bactérias meningocócicas. A nosso conhecimento, nenhum outro modelo da meningite meningococcal foi desenvolvido nos ratos do laboratório contaminados pelo i.cist. rota; no passado, desta forma tem sido explorada para fornecer modelos de meningite meningocócica em ambos os ratos³¹ e coelho³². É sabido que a maior taxa de doença me…

Materials

1,8 Skirted Cryovial With external thread	Starlab	E3090-6222
50ml Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070	30 x 115mm
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	Stainless Steel
Alarm-Thermometer	TESTO	9000530
BactoTM Proteose Peptone	BD	211693
BD Micro Fine syringe	BD	320837	U-100 Insulin
BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in	BD	300014	05x16mm
BD Plastipak syringe 5ml	BD	308062	07 x 30mm
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET	Bio Air s.c.r.l.	Aura B3
BioPhotometer	Eppendorf	Model #6131
Bottle D	Tecniplast	D	Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm
C150 CO2 Incubator	Binder	9040-0078
Cage Body Eurostandard Type II	Tecniplast	1264C	267x207x140mm, Floor area 370cm2
Cell Culture Petri Dish With Lid	Thermo Scientific	150288	Working Volume: 5mL
Centrifuge	Eppendorf	Microcentrifuge 5415R
Cuvetta semi-micro L. Form	Kartell S.p.A.	01938-00
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate	Carlo erba	471767
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis	Carlo Erba	480141	g1000
Diete Standard Certificate	Mucedola s.r.l.	4RF21	Food pellet for animal
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel	F.S.T. by DUMONT	AGT5034	0,10 x 0,06 mm tip
Electronic Balance	Gibertini	EU-C1200	Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock	Eppendorf	T3545-1000EA
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E-6376	25g
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08	Stainless Steel
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps	Tecniplast	1264C400SUC
GC agar base	OXOID	CM0367
Gillies Forceps 1 x2 teeth	F.S.T.	11028-15	Stainless Steel
Glicerin RPE	Carlo Erba	453752	1L
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10	Serrated Tip Width: 0.8mm
Inner lid	Tecniplast	1264C116
Iron dextran solution	Sigma-Aldrich	D8517-25ML
Ketamine	Intervet
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II	Faster	BH-EN 2004
Microcentrifuge tubes 1.5ml	BRAND	PP780751	screw cap PP, grad
Mouse Handling Forceps	F.S.T.	11035-20	Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm
Mucotit-F2000	MERZ	61846	2000ml
Natural Latex Gloves	Medica	M101
New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker	PBI international	C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker
Petri PS Dishes	VWR	391-0453	90X14.2MM
Pipetman Classic P20	Gilson	F123600	2-20microL
Pipetman Classic P200	Gilson	F123601	20-200microL
Pipetman Classim P1000	Gilson	F123602	200-1000microL
Polyvitox	OXOID	SR0090A
Potassium Chloride	J.T. Baker Chemicals B.V.	0208	250g
Potassium Dihydrogen Phosphate	J.T. Baker Chemicals B.V.	0240	1Kg
PS Disposible forceps	VWR	232-0191
Removable Divider	Tecniplast	1264C812
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Falcon	352063	5ml
Sodium Chloride	MOLEKULA	41272436
SS retainer and Polyester FilterSheet	Tecniplast	1264C
Standard Pattern Forceps	F.S.T.	11000-12	Stainless
Stevens Tenotomy Scissors	F.S.T.	14066-11	Stainless Steel
Surgical Scissor – ToughCut	F.S.T.	14130-17	Stainless
Touch N Tuff disposible nitrile gloves	Ansell	92-500
Ultra Low Temperature (ULT) Freezer	Haier	DW-86L288	Volume= 288L
Wagner Scissors	F.S.T.	14070-12	Stainless Steel
Xylazine	Intervet