인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도
Summary
여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 감염의 내성인종 경로를 통해 수막구균 뇌막염을 유도하는 방법을 기술합니다. 우리는 접종의 준비에서 내질 감염에 수막 구균 감염의 단계 프로토콜에 의해 단계를 제시; 그런 다음 동물의 생존을 기록하고 뮤린 조직에서 세균 부하를 평가합니다.
Abstract
Neisseria 수막염 (meningococcus)는 세균성 뇌막염의 주요 원인으로 세계적으로 인식되는 좁은 호스트 범위 미생물입니다. 수막구균은 건강한 대상체의 약 10%의 인간 비인두의 일시적인 식민지입니다. 특히 상황에서, 그것은 점 막 장벽을 관통 하 고 패 혈 증을 일으키는 혈 류를 침공 하는 침략 능력을 취득. 최신 케이스에서는, 완충 패혈증은 뇌막염의 결과적인 발달 없이조차 생길 수 있었습니다. 반대로, 박테리아는 혈 류에서 제대로 증식 수 있습니다., 혈액 뇌 장벽을 교차, 중앙 신 경계에 도달, 충만 뇌 막염으로 이어지는. 세균성 뇌막염의 murine 모형은 호스트 병원체 상호 작용을 조사하고 이 치명적인 질병에 책임 있는 병원유전적 기계장치를 분석하기 위하여 유용한 공구를 나타냅니다. 비록, 몇몇 실험적인 모형 시스템은 지난 십년간 에 걸쳐 평가되었더라도, 이들 중 어느 것도 수막구균 질병의 특징적인 병리학 적인 사건을 재현할 수 없었습니다. 이 실험 프로토콜에서, 우리는 박테리아의 내성 계발성 접종에 근거를 둔 마우스 모형에 있는 수막구균 뇌막염의 유도를 위한 상세한 절차를 기술합니다. 인간 뇌막염의 특이한 징후는 임상 매개 변수 (예를 들어, 온도, 체중), 생존율 평가, 미생물 학적 분석 및 뇌 손상의 조직 학적 검사의 평가를 통해 뮤린 호스트에 기록되었다. intracisternal를 사용하는 경우 (i.cist.) 접종, 수막 구균은 시스터나마그나로 직접 전달, 뇌 조직에서 매우 효율적인 수막 구균 복제로 이어지는. 박테리아의 실행 가능한 수의 1,000 배 증가는 대략 18 시간에서 관찰됩니다. 더욱이, 수막구균은 또한 감염된 마우스의 비장, 및 간에서 발견되며, 이는 간이 수막구균 복제를 위한 표적 기관을 나타낼 수 있음을 시사한다.
Introduction
Neisseria 뇌막염은 인간 호스트에 국한된 그람 음성 β-proteobacterium, 잘 전 세계에 걸쳐 인간 인구에 있는 뇌막염 그리고 패혈증의 일반적인 원인의 한개인 것으로 잘 알려져 있습니다. 그것은 건강하고 무증상 운반대의 상부 호흡기 (코와 목)를 식민지화합니다 (인구의 2-30%), 그러나 박테리아는 때때로 각종 호스트 면역 방어를 회피하고 통제되지 않는 현지를 일으키는 원인이 되는 두뇌에 혈류량에서 퍼집니다 염증, 수막 구균 수막염으로 알려진. 숙주와 세균계수의 조합은 공생에서 침습적행동으로의전환에 기여하는 것으로 보인다 1 .
N. 뇌막염은 인간 식민지화 및 감염에 독점적으로 전문화됩니다. 그것은 좁은 숙주 범위를 가지고 있고, 따라서, 인간 수막구균 질병을 재생하는 적당한 동물 모형의 부족 때문에 생체 내 병인 성 연구에서 제한되었습니다. 그 결과, 수막구균에 의한 패혈증과 뇌막염의 병인에 관한 이해의 근본적인 간격으로 이어졌습니다. 지난 수십 년 동안, 많은 시험관 내 시스템의 발달은 여러 수막 구균 독성 인자2,3,4의식별을 허용했다. 이러한 귀중한 연구는 성공적인 수막 구균 감염을 위한 이 요인의 역할을 이해하기 위하여 중요한 통찰력을 제공했더라도, 이 모형은 체액성 및 세포와 세균성 상호 작용의 결과의 평가를 허용하지 않았습니다 면역 체계와 전체 조직도 적습니다. 감염의 생체 내 동물 모델은 백신 제형에 의해 부여된 보호 정도의 평가뿐만 아니라 큰 관련성을 가지고 있다. 인간 열대 병원체로서, 수막구균은 표면 구조 (즉, 타입 IV 필리 및 불투명도 단백질) 및 인간 수용체 및 수송 단백질을 위한 철 섭취 시스템 (즉, 및 수송 단백질)과 같은 성공적인 감염에 필요한 적절한 결정요인을 가지고 있습니다. transferrin 및 락토페린)5,6,7을 올바르게 부착하고 생존하고 인간 숙주에게 침입합니다. 마지막으로, 인간의 면역 반응을 회피 및/또는 차단하는 병원체의 유전적 변이 능력은 고종 트로피즘8,9에더욱 기여한다. 따라서, 상호 작용에 관여하는 특정 숙주 인자의 부재는 병원체의 수명 주기의 단계를 차단할 수 있으며, 수막 구균 수명 주기를 요약하는 작은 동물 모델의 개발에 상당한 어려움을 확립 할 수 있습니다.
지난 수십 년 동안, 수막구균 전염주기의 우리의 이해를 향상시키기 위하여 몇몇 접근은 개발되었습니다. 두 동물 모델, 마우스와 쥐의 감염, 복강 내 (i.p.) 또는 intranasally (i.n.), 수막 구균 질환을 재현하기 위해 개발되었다10,11,12,13,14 ,15,16,17. 실험실 마우스는 아마 실험적인 수막구균 감염을 유도하기 위한 더 다재다능한 동물의 한개입니다.
그러나, i.p. 감염의 방법은 감염의 자연적인 경로를 모방하지 않더라도 가혹한 패혈증의 발달로 이끌어 냅니다, 반면 감염의 i.n. 경로는 폐 감염을 유도할 수 있더라도 수막구균 병인증을 평가하기 위하여 유용했습니다 패혈증10,11,12, 13,14,15,16,17.
i.p. 마우스 모델은 수막구균 도전10,11,12로부터의보호를 평가하는 데 중요한 역할을 했다. 감염의 i.n. 경로에 기초한 수막구균 식민지화의 마우스 모형은 인간에 있는 수막구균 질병의 과정을 모방하는 침략적인 감염을 재생하기 위하여, 수막구균에 더 영향을 받기 쉽기 때문에, 유아 마우스로 개발되었습니다 13,14,15,16,17. 더욱이, 뮤린 숙주에서 수막구균 복제를 촉진하기 위해, 감염을 개선하기 위해 동물에게 철분 투여, 높은 세균접종의 사용, 마우스-통로 세균성 균주뿐만 아니라 유아 또는 면역 손상된 동물의고용은 10,13,15,18,19. CD4620 또는 트랜스퍼린21과 같은 특정 인간 요인의 발현은 이 인간-열대 박테리아에 대한 마우스의 감수성을 증가시켰습니다. 감염의 인간 피부 이종이식 모델의 고용은 또한 인간내피(22,23)에대한 수막구균의 부착 능력을 평가하는 데 유용하였다. 종합적으로, 인간화형 형질전환 마우스의 최근 발달은 수막구균 병인 및 숙주 상호작용의 이해를 향상시켰다.
이전에는 쥐계세균24를 이용한 성인마우스의 시스터나 마그나로 세균의 접종을 수행한 수막구균 수막염의뮤린 모델을 개발하였다. 임상 적 매개 변수 및 감염된 마우스의 생존율은 인간 숙주에서 볼 수있는 것과 유사한 특성을 가진 뇌막염의 확립뿐만 아니라 뇌의 미생물 및 조직학적 분석을 입증했습니다. 이 감염된 마우스로부터, 박테리아는 또한 혈액, 간 및 비장으로부터 회복되었고, 말초 장기로부터의 세균 부하가 감염성 투여량과 상관되었다. 특히, 이 모델은 L-글루타메이트 수송기GltT 24에서결함이 있는 이소제성 돌연변이균의 독성을 평가하기 위해 사용되었다. 최근, i.cist에 근거를 둔 수막구균 뇌막염의 우리의 마우스 모형을 이용하. 혈청군 C균93/42862,24 및 UDP-N-아세틸루코민 2-에피메라제2-에피메라아제2에 대한 cssA 유전자 인코딩에 결함이 있는 이소제돌연변이결함25를 가진 경로, 우리는 설립시 에피메라제(25)에 노출된 시알산의 역할을 분석하였다. 쥐의 질병.
이 프로토콜에서, 우리는 i.cist에 근거를 둔 실험적인 수막구균 뇌막염을 유도하는 간단한 방법을 기술합니다. Balb/c 성인 마우스에서 감염 경로. 이 방법은 특히 뮤린 숙주에서 수막구균 감염의 특성화뿐만 아니라 야생형 참조 균주 및 동인 성 돌연변이체 사이의 독성의 평가에 유용하다. 감염의 내부 -cisternal 경로는 차례로 뇌척수액 (CSF)에서 세균 복제를 용이하게하고 그 모방 기능을 가진 뇌막염을 유도 하는 시스터나 마그나에 직접 수막 구균의 완전한 전달을 보장 인간에 존재하는2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는, 우리는 i.cist에 의해 성인 마우스에 있는 수막구균 뇌막염을 유도하는 실험적인 프로토콜을 기술합니다. 수막 구균 박테리아의 접종. 우리의 지식에, 수막 구균 뇌막염의 다른 모델은 i.cist에 의해 감염된 실험실 마우스에서 개발되지 않았습니다. 경로; 과거에는, 이 쪽은 쥐(31)와 토끼(32)둘 다에 있는 수막구균 뇌막염의 모형을 제공하기 위하여 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 PRIN 2012 [부여 번호 2012WJSX8K]에 의해 부분적으로 지원되었다: “점막 감염에 있는 호스트 미생물 상호 작용 모형: 새로운 치료 전략의 발달” 및 PRIN 2017 [2017SFBFER]에 의해: “상호 작용을 해결하기 위한 통합된 접근법 적응, 스트레스 조건 및 도전 병원 체의 항균 저항”.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Referências
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