インティリカレルナルデリバリーによるマウスにおける髄膜炎球炎血清群Cの誘導
Summary
ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。
Abstract
髄膜炎(髄膜炎)は狭い宿主範囲の微生物であり、世界的に細菌性髄膜炎の主な原因として認識されています。髄腔球菌は、健康な被験者のおよそ10%のヒト鼻咽頭の一過性の植民地である。特に状況では、粘膜関門を貫通する侵襲的な能力を獲得し、敗血症を引き起こす血流に侵入する。最新のケースでは、髄炎の結果的な発症がなくても、敗血症のフルミネリングが発生する可能性があります。逆に、細菌は血流の中で十分に増殖し、血液脳関門を通過し、中枢神経系に達し、フルミナント髄炎につながる可能性があります。細菌性髄炎のマウスモデルは、宿主と病原体の相互作用を調査し、この致死性疾患を引き起こす病因のメカニズムを分析するのに有用なツールを表す。しかし、過去数十年間にいくつかの実験モデルシステムが評価されてきたが、これらのいずれも髄膜炎球菌疾患の特徴的な病理学的事象を再現できなかった。この実験プロトコルでは、細菌の不必要な接種に基づくマウスモデルにおける髄膜炎球菌性髄膜炎の誘導に関する詳細な手順について説明する。ヒト髄炎の特異な徴候は、臨床パラメータ(例えば、温度、体重)の評価、生存率の評価、微生物学的分析および脳損傷の組織学的検査を通じてマウス宿主に記録された。インティリテーラーナル(i.cist.)接種を使用する場合、髄膜球菌はシステナマグナに直接完全に送達し、脳組織における非常に効率的な髄膜炎球菌複製をもたらす。約18時間で生存可能な数の生存率の1,000倍の増加が観察される。さらに、髄膜球菌は脾臓、および感染したマウスの肝臓にも見られ、肝臓が髄膜炎球菌複製の標的器官を表す可能性があることを示唆している。
Introduction
ナイセリア髄膜炎は、世界中の人間集団における髄膜炎および敗血症の最も一般的な原因の1つとしてよく知られている、ヒト宿主に限定されたグラム陰性β-プロテオバクテリウムである。健康で無症候性の担体(人口の2~30%)の上気道(鼻と咽喉)を植民地化しますが、細菌は時々様々な宿主の免疫防御を回避し、血流から脳に広がり、制御されない局所を引き起こします髄膜炎菌性髄膜炎として知られている炎症。宿主と細菌因子の組み合わせは、侵襲的な行動1への収容者からの移行に寄与しているように見える。
N. 髄膜炎は、ヒトの植民地化と感染に特化しています。それは狭い宿主範囲を有し、したがって、ヒト髄膜炎菌性疾患を再現する適切な動物モデルの欠如による生体内病因の研究に限られている。その結果、髄菌によって引き起こされる敗血症および髄炎の病因に関する理解の根本的なギャップにつながっていた。過去数十年の間に、多くのin vitroシステムの開発は、いくつかの髄膜炎球菌毒性因子2、3、4の同定を可能にした。これらの貴重な研究は、髄膜炎球菌感染の成功に対するこれらの因子の役割を理解するための重要な洞察を提供したが、これらのモデルは、体液性および細胞との細菌相互作用の結果の評価を可能にしなかった免疫システムと組織全体でさらに少ない.感染の生体内動物モデルは、ワクチン製剤によって与えられる保護度の評価のためにも大きな関連性がある。ヒト-熱帯病原体として、髄膜球菌は、表面構造(すなわち、IV型ピリおよび不透明性タンパク質)およびヒト受容体および輸送タンパク質の鉄取り込みシステム(すなわち、トランスフェリンおよびラクトフェリン)5、6、7は、適切に付着し、生き残り、ヒト宿主に侵入する。最後に、病原体の遺伝的変動能力は、ヒト免疫応答を回避および/またはブロックし、さらに高種のトロピズム8、9に寄与する。したがって、相互作用に関与する特定の宿主因子の欠如は、病原体のライフサイクルのステップを遮断し、髄膜炎球菌ライフサイクルを要約する小動物モデルの開発において重大な困難を確立する可能性がある。
過去数十年にわたり、髄膜炎菌感染周期に対する理解を深めるために、いくつかのアプローチが開発されてきました。マウスとラットの2つの動物モデルの感染症は、腹腔内(i.p.)または内膜(i.n.)のいずれかであり、髄膜炎球菌性疾患10、11、12、13、14を再現するために開発された ,15,16,17.実験室のマウスは、おそらく実験的な髄膜炎菌感染を誘発するためのより汎用性の高い動物の一つです。
しかし、i.p.感染の方法は、感染の自然な経路を模倣していないが、重度の敗血症の発症につながるのに対し、i.n.感染経路は髄膜炎球菌病因を評価するのに有用であったが、肺感染を誘発する可能性があるにもかかわらず、敗血症10、11、12、13、14、15、16、17に先立ちます。
i.p.マウスモデルは、髄膜炎球菌チャレンジ10、11、12からの保護を評価するのに役立ちました。感染経路に基づく髄膜炎菌のコロニー形成のマウスモデルは、乳児マウスで開発されており、髄膜炎球菌の影響を受けやすいため、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患の経過を模倣した侵襲的感染を再現する13、14、15、16、17.さらに、マウス宿主における髄膜炎球菌複製を促進するために、感染を改善するために動物に対する鉄の投与を含む技術戦略の増加、高細菌イオクムの使用、マウス通過細菌株ならびに乳児または免疫不全動物宿主の雇用は、10、13、15、18、19である。CD46 20またはトランスフェリン21のような特定のヒト因子の発現は、このヒト熱帯細菌に対するマウスの感受性を増加させた。感染のヒト皮膚異種移植片モデルの採用はまた、ヒト内皮22、23に髄腔球菌の接着能を評価するのに有用であった。総称して、ヒト化トランスジェニックマウスの最近の発達は、髄膜炎球菌病因とその宿主相互作用の理解を改善した。
以前は、マウス通過菌24を有する成体マウスのシステナマグナに細菌の接種を行った髄膜炎菌性髄膜炎のマウスモデルを開発した。臨床パラメータおよび感染マウスの生存率は、ヒト宿主に見られるものに匹敵する特性を有する髄炎の確立、ならびに脳の微生物学的および組織学的分析を実証した。これらの感染マウスから、細菌は、また、血液、肝臓、脾臓から回収され、そして感染性線量と相関する末梢器官からの細菌負荷であった。特に、このモデルは、L-グルタミン酸トランスポーターGltT24における欠陥のある等素変異株の毒性を評価するために採用された。最近、i.cistに基づく髄膜炎菌性髄膜炎のマウスモデルを用いた。セログループC株93/42862、24およびUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ25に対するcssA遺伝子に欠陥のある等因性変異体を有する経路は、確立における露光シアル酸の役割を分析したマウスの病気の。
このプロトコルでは、i.cistに基づいて実験的髄膜炎菌性髄膜炎を誘導する簡単な方法を説明する。バルブ/c成体マウスにおける感染経路。この方法は、マウス宿主における髄膜炎球菌感染の特徴付け、ならびに野生型参照株と等因性変異体との間の病原性の評価のために特に有用である。感染の内細菌経路は、髄膜癌菌をシステナ・マグナに直接完全に送達することを保証し、脳脊髄液(CSF)における細菌複製を促進し、それらを模倣する特徴を有する髄膜炎を誘発するヒト2、24、25、26に存在する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、i.cistによる成人マウスにおける髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する実験プロトコルについて述べている。髄膜炎菌の接種私たちの知る限りでは、髄膜炎菌性髄膜炎の他のモデルは、i.cistによって感染した実験室マウスで開発されていません。ルート;過去に、この方法は、ラット31とウサギ32の両方で髄膜炎球菌性髄膜炎のモデルを提供するために?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、PRIN 2012 [付与番号 2012WJSX8K]によって部分的にサポートされました: “粘膜感染症における宿主微生物相互作用モデル:新しい治療戦略の開発”と PRIN 2017 [2017SFBFER]: “間の相互作用に取り組むための統合されたアプローチ適応、ストレス条件と挑戦的な病原体の抗菌性」。
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Referências
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