Summary
Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.
Abstract
L'imagerie en accéléré cellulaire en direct est un outil important en biologie cellulaire qui donne un aperçu des processus cellulaires qui pourraient autrement être négligés, mal compris ou mal interprétés par l'analyse des cellules fixes. Bien que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes soient robustes et suffisantes pour observer l'état stable cellulaire, elle peut être limitée dans la définition d'un ordre temporel des événements au niveau cellulaire et est mal équipée pour évaluer la nature transitoire des processus dynamiques, y compris progression mitotique. En revanche, l'imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires au niveau d'une seule cellule au fil du temps et a la capacité de capturer la dynamique des processus qui seraient autrement mal représentés dans l'imagerie cellulaire fixe. Ici nous décrivons une approche pour produire des cellules portant des marqueurs fluorescents étiquetés de chromatine et de microtubules et leur utilisation dans les approches vivantes d'imagerie de cellules pour surveiller l'alignement de chromosome de métaphase et la sortie mitotique. Nous décrivons des techniques basées sur l'imagerie pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique, y compris l'identification des cellules à divers stades de la mitose, l'identification et le suivi des défauts mitotiques, et l'analyse de la dynamique du fuseau et destin de cellule mitotique suivant le traitement avec des inhibiteurs mitotic.
Introduction
L'analyse basée sur l'image des cellules fixes est couramment utilisée pour évaluer les changements de niveau de population cellulaire en réponse à diverses perturbations. Lorsqu'elles sont combinées avec la synchronisation cellulaire, suivie par la collecte et l'imagerie des points de temps de série, ces approches peuvent être utilisées pour suggérer une séquence cellulaire des événements. Néanmoins, l'imagerie cellulaire fixe est limitée en ce que les relations temporelles sont implicites pour une population et non démontrées au niveau des cellules individuelles. De cette façon, alors que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes sont suffisantes pour observer des phénotypes robustes et des changements d'état stable, la capacité de détecter les changements transitoires au fil du temps et les changements qui n'ont d'impact qu'une sous-population des cellules est imparfaite. En revanche, l'imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires et subcellulaires au sein d'une seule cellule, ou population cellulaire, au fil du temps et sans l'aide d'approches de synchronisation qui peuvent eux-mêmes avoir un impact sur le comportement cellulaire 1 Fois , 2 (en) , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6.
La formation d'un fuseau mitotique bipolaire est essentielle pour la ségrégation appropriée de chromosome pendant la division cellulaire, ayant pour résultat deux cellules de fille génétiquement identiques. Les défauts dans la structure mitotique de fuseau qui corrompent la progression mitotique et compromettent la fidélité de la ségrégation de chromosome peuvent avoir comme conséquence des divisions cellulaires catastrophiques et la viabilité réduite de cellules. Pour cette raison, les poisons mitotiques qui modifient la formation de fuseau sont des thérapies prometteuses pour limiter la prolifération rapide des cellules cancéreuses7,8,9. Néanmoins, l'analyse cellulaire fixe de la structure du fuseau à la suite de l'ajout de poisons mitotiques est limitée dans sa capacité à évaluer le processus dynamique de formation du fuseau et peut ne pas indiquer si les changements observés dans la structure du fuseau sont permanents ou sont au lieu transitoire et peut être surmonté pour permettre la division cellulaire réussie.
Dans ce protocole, nous décrivons une approche pour évaluer la dynamique de la mitose suivant des perturbations de fuseau par la formation image de cellules vivantes. Utilisation de la lignée cellulaire RPE-1 immortalisée par hTERT conçue pour exprimer un Histone 2B marqué par la DP pour visualiser la chromatine, ainsi qu'une tubuline étiquetée EGFP pour visualiser les microtubules, le moment de l'alignement des chromosomes métaphase, l'enclenchée et, en fin de compte, Le destin de cellule mitotique sont évalués utilisant des indices visuels du mouvement de chromosome, du compactage, et de la morphologie nucléaire.
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Protocol
1. Génération de cellules hTERT-RPE-1 exprimant de façon stable la DP-Histone 2B (RFP-H2B) et le 'tubulin-EGFP'(tub-EGFP)
REMARQUE : Toutes les étapes suivent des techniques aseptiques et se déroulent dans un coffret de sécurité de niveau de biosécurité II (BSL2MD).
- Générer le rétrovirus porteur des gènes d'intérêt (-tubulin-EGFP et RFP-H2B) par la transfection des cellules 293T avec les plasmides lentiviraux appropriés selon les instructions du fabricant du système de transfection à base de lipides.
- Jour 1 : Utilisez une pipette Pasteur en verre jetable pour aspirer le milieu de culture cellulaire à partir d'une plaque de cellules 293T sous-confluentes et lavez le milieu résiduel avec de la saline tamponnée en phosphate (PBS) en ajoutant 5 ml de PBS. Tourbillonner pour distribuer PBS sur le fond de la plaque, puis aspirer le PBS avec une pipette stérile en verre pasteur en verre.
- Ajouter 2 ml de trypsine de 0,05 % qui a été réchauffé e à 37 oC et remettre la plaque dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 2 à 5 min pour permettre aux cellules adhérentes d'être libérées de la surface du plat de culture cellulaire.
- Ajouter 8 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 1 % de pénicilline/streptomycine dans la plaque contenant de la trypsine.
- Resuspendre les cellules en pipetilage doucement et transférer la suspension à un tube conique stérile de 15 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
- Aspirez la solution moyenne/trypsine des cellules granulées et resuspendez des cellules dans 10 ml de DMEM complétée s'est complétée par 10% de FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Utilisez un hémocytomètre pour compter la suspension des cellules 293T et la plaque 2 x 106 cellules 293T par puits d'une plaque de 6 puits.
- Cellules de culture dans un volume total de 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine et de maintenir dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5% CO2.
- Jour 2 : Pipette 7 L de réactif de transfection à base de lipides et 100 l de milieu sérique réduit dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et lui permettre d'incuber à température ambiante pendant 5 min (tube #1).
- Dans un tube de microcentrifuge distinct de 1,5 ml, pipette 1 g de vecteur d'expression RFP-H2B (ou 1 g de vecteur d'expression de tubulin-EGFP), ainsi que 5 réagents d'exhausteur de l'année (selon les directives du fabricant), 0,5 g de pMD2.G, et 1 g de psPAX2 et 100 l de milieu sérique (tube #2).
- Combinez le contenu de l'étape 1.1.7 et l'étape 1.1.8 en faisant soigneusement la #2 de tube dans le tube #1 et incuber pendant 20 min à température ambiante.
REMARQUE : La réaction peut être mise à l'échelle au besoin pour la transfection des cellules dans d'autres puits. - Pipette la réaction de transfection goutte à l'heure du puits désiré contenant 293T cellules dans 2 ml de milieu et de retourner le plat à l'incubateur humidifié à 37 oC avec 5% CO2.
REMARQUE : Pour générer des cellules exprimant à la fois la DP-H2B et le 'tubulin-EGFP,' générer un virus distinct pour chaque construction d'expression (étapes 1.1.7- 1.1.9). - Jour 3: Aspirer et remplacer le milieu par 2 ml de DMEM frais complété s'est complété de 10% FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Remettre le plat à l'incubateur humidifié à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Jour 4 : Recueillir le milieu contenant des particules virales exprimées, en faisant preuve de prudence pour ne pas perturber ou enlever les cellules 293T. Filtrer le milieu contenant des particules virales en le passant à travers un filtre de 0,45 M attaché à une seringue de 5 ml. Virus Aliquot pour un stockage à court terme à 4 oC, ou un stockage à long terme à -80 oC.
REMARQUE : Les particules virales obtenues de cette manière seront présentes dans une fourchette de 1 x 107 à 1 x 108 Unités de transduiseur/mL. Comme les cellules et les cellules productrices virales à infecter sont toutes deux cultivées dans le même milieu, la concentration virale pour remplacer le milieu n'est pas nécessaire et les particules virales filtrées peuvent être utilisées directement pour infecter les cellules. - Seed 2 x 105 hTERT-RPE-1 cellules par puits d'un plat de 6 puits en préparation de l'infection virale. Cellules de culture dans 2 ml de DMEM complétées avec 10% FBS et 1% pénicilline/streptomycine et maintiennent dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5% de CO2.
- Jour 5 : Ajouter le bromure d'hexadimethrine (p. ex., polybrene) aux cellules hTERT-RPE-1 à une concentration finale de 8 g/mL. Infecter les cellules avec un mélange de 500 l de virus dilué dans 500 l de milieu de culture cellulaire.
REMARQUE : La solution de stock de bromure d'hexadimethrine est préparée dans de l'eau distillée stérile, puis filtrée à travers un filtre de 0,45 m. - Jour 6: À l'aide d'une pipette Pasteur en verre jetable, aspirer le milieu des puits contenant les cellules infectées par le virus. Remplacer le milieu de culture cellulaire par 2 mL de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, et des concentrations appropriées d'antibiotiques à sélectionner pour l'intégration et l'expression plasmide.
REMARQUE : Le plasmide d'expression de la tubuline-EGFP utilisé dans les expériences décrites porte un gène de résistance à la puromycine et le plasmide d'expression RFP-H2B porte un gène de résistance à la blasticidin. Par conséquent, 10 g/mL de puromycine et 2 g/mL de blasticidin sont utilisés pour la sélection des cellules RPE-1 de la RFP-H2B. Les concentrations d'antibiotiques utilisés pour la sélection peuvent différer pour les différentes lignées cellulaires utilisées. - Maintenir les cellules sous sélection d'antibiotiques pendant 5-7 jours, en remplaçant le milieu tous les 3 jours par un milieu frais contenant des réactifs de sélection appropriés.
REMARQUE : Les cellules doivent être maintenues à la sous-confluence pendant la sélection et devraient être élargies au besoin, comme décrit dans les étapes 1.1.1 à 1.1.4. - Utilisez l'imagerie par immunofluorescence pour confirmer l'expression des constructions étiquetées.
REMARQUE : Si désiré, des clones de cellules uniques peuvent être dérivés pour obtenir des niveaux d'expression uniformes au sein de la population cellulaire. Une fois que les clones stables sont confirmés, les cellules peuvent être maintenues dans les conditions de culture standard en l'absence de sélection d'antibiotiques.
2. Préparation des cellules pour l'imagerie cellulaire vivante suite à des perturbations de fuseau mitotique
REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques et effectuez les étapes dans une armoire de sécurité BSL2.
- À l'aide d'une pipette pasteur en verre jetable stérile, aspirez le milieu de la plaque de culture contenant la ligne cellulaire qui porte l'expression construct(s) (à partir de l'étape 1.7). Laver brièvement les cellules avec 10 ml de PBS stérile. Tourbillonner pour distribuer PBS sur le fond de la plaque, puis aspirer PBS avec une pipette stérile en verre jetable Pasteur.
- Ajouter 2 ml de trypsine de 0,05 % dans la plaque de 10 cm. Incuber la plaque à 37 oC pendant 2-5 min ou jusqu'à ce que les cellules se soient détachées de la surface de la plaque.
- Ajouter 8 ml de milieu frais à la plaque contenant de la trypsine. Resuspendre les cellules en pipetilage doucement et transférer la suspension à un tube conique stérile de 15 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
- Aspirez soigneusement le supernatant et resuspend ezif dans 10 ml de PBS en pipetting doucement avec une pipette sérologique de 10 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
- Aspirez soigneusement le supernatant et resuspendez dans 10 ml du milieu frais en pipetting doucement avec une pipette sérologique de 10 ml.
- Compter les cellules, puis calculer le nombre cellulaire à l'aide d'un hémacytomètre et diluer à une concentration de 1-2 x 105 cellules/mL dans le milieu de culture cellulaire. Graine 500 l de la suspension cellulaire à chaque puits d'une plaque inférieure stérile de 12 puits d'imagerie. Placez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire et laissez les cellules adhérer à la surface de la plaque.
REMARQUE : L'imagerie cellulaire vivante exige que les cellules soient bien respectées afin qu'elles restent associées au plan d'imagerie pendant l'acquisition de l'image. La durée du temps nécessaire pour que les cellules adhèrent après le placage peut différer d'une lignée cellulaire à l'autre et devrait être optimisée pour la lignée cellulaire à l'étude. - Jusqu'à 30 minutes avant de commencer l'imagerie en accéléré, ajouter une concentration pertinente d'un médicament mitotique à un ou plusieurs des puits ensedus de cellules. Pour tenir compte de l'impact potentiel du solvant organique sur le comportement cellulaire, ajoutez un volume égal de diluant de l'inhibiteur aux cellules comme témoins. Par exemple, assurez-vous que l'ajout de 100 nM de l'inhibiteur spécifique de la kinase mitotique Aurora A (par exemple, alisertib) est parallèle à un volume égal de DMSO, le diluant pour ce médicament, dans un puits témoin de cellules.
REMARQUE : L'analyse comparative des changements dynamiques dans la progression mitotique exige des puits des cellules à préparer en l'absence de perturbations pour permettre l'imagerie des mitoses normales en parallèle aux conditions expérimentales.
3. Microscope mis en place pour l'imagerie en accéléré des cellules exprimant esquissées par la DP-H2B, la tubuline-GFP (Figure 1, Figure 2)
- Placez la plaque de culture cellulaire contenant la DP-H2B, la tubuline-GFP exprimant les cellules hTERT RPE-1 pour qu'elles soient représentées dans un insert d'étape approprié sur un microscope à épifluorescence inversée équipé d'une caméra haute résolution (taille de pixels de 0,67 m à 20x), un chambre environnementale préchauffé à 37 oC, et un système de livraison pour humidifié 5% CO2.
REMARQUE : Des chambres environnementales fermées ou des inserts d'étape à température contrôlée peuvent être appropriés à condition que le CO2 humidifié de 5 % puisse être livré et que le contrôle de la température soit obtenu. - Utilisez un objectif d'air 20x avec une ouverture numérique de 0,5 et équipé pour la fluorescence de contraste élevé et le contraste de phase ou l'imagerie brightfield. Voir les cellules avec le contraste de phase ou brightfield et ajuster le cours et la mise au point fine sur le microscope pour mettre les cellules au point.
- Identifiez et fixez les temps d'exposition optimaux pour l'acquisition d'images brightfield, GFP et DP en sélectionnant le cube de filtre respectif avec une excitation et une émission appropriées pour les fluorophores qui seront représentés. Vous pouvez également cliquer sur le bouton d'exposition automatique pour entrer un temps d'exposition prédéterminé. Si le signal n'est pas suffisamment intense, sélectionnez le binning de pixel pour permettre des temps d'exposition plus courts en cliquant sur l'onglet binning et en sélectionnant 2 x 2 pixels binning du menu de descente.
REMARQUE : La phototoxicité peut nuire à la progression mitotique et à la viabilité cellulaire. L'échec des cellules mitotiques dans les populations témoins pour compléter les mitoses normales peut être une indication que les temps d'exposition et / ou la durée de l'imagerie doit être encore optimisée. - Utilisez un logiciel d'acquisition et d'analyse qui permet d'acquérir simultanément l'imagerie multi-coordonnées et multi-puits et de définir les paramètres de l'acquisition d'images.
- Sélectionnez et étalonnez l'étape du microscope pour le plat multi-puits, selon les instructions du fabricant. Utilisez le logiciel d'acquisition d'images pour mettre en évidence ou sélectionner les puits qui seront photographiés en cliquant sur les puits pertinents dans le diagramme du format de plaque qui est utilisé.
- Sous le panneau de contrôle GeneratedPoints (Figure 2), définissez les coordonnées de chaque puits qui seront représentées en cliquant sur l'onglet Point Placement et en sélectionnant le placement de coordonnées prédéfinis ou aléatoires à partir de le menu de baisse. Sélectionnez l'onglet Zone de travail et sélectionnez restreint dans le menu déroulant pour limiter la zone de sélection de coordonnées afin d'exclure les limites du puits. Cliquez sur les onglets Compter et Distribution pour sélectionner le nombre et la distribution des points à capturer par puits, respectivement.
REMARQUE : Le nombre de coordonnées pouvant être représentées par puits dans l'incrément de 5 minutes sera limité par le nombre de puits à imager, ainsi que par le temps d'exposition de chaque canal. Typiquement, 5-8 coordonnées par puits sont suffisantes pour observer au moins 50 cellules dans chaque progression de condition par mitose dans un délai de 4 h. - Sélectionnez et entrez l'intervalle de temps et la durée pour collecter des images en cliquant sur et en entrant les valeurs dans le panneau de contrôle TimeSequence.
REMARQUE : L'acquisition d'images toutes les 1 à 5 minutes est appropriée pour surveiller la dynamique de la progression mitotique. La durée globale de l'imagerie devrait refléter le point de terminaison et le taux de prolifération souhaités de la lignée cellulaire. Par exemple, 4 heures est suffisante pour voir de nombreuses cellules progresser à travers la mitose, 16 heures est suffisante pour voir la plupart des cellules RPE-1 dans une population asynchrone progresser par mitose.
4. Analyse d'image time-lapse pour déterminer le moment de la métaphase et le sort des cellules mitotiques à la suite de perturbations mitotiques du fuseau
REMARQUE : Effectuez l'analyse d'image à l'aide d'un logiciel d'acquisition d'images(Tableau des matériaux),ImageJ, ou d'un logiciel d'analyse d'images comparable.
- Visualisez la chromatine étiquetée RFP-H2B en sélectionnant les images capturées avec le cube de filtre DeP en place. Identifiez une cellule entrant dans la mitose telle qu'indiquée par le compactage initial de la chromatine(figure 2C, tête de flèche bleue) et l'enveloppe nucléaire se décomposent (lorsque l'émabuline-EGFP n'est plus exclue par la limite nucléaire).
- Déterminer le moment mitotique de l'alignement des métaphases et de l'apparition de l'anaphase dans les cellules individuelles : Suivez la cellule à travers des points de temps consécutifs dans le film acquis afin de déterminer le nombre de points de temps/minutes entre l'entrée mitotique jusqu'à la chromatine étiquetée RFP-H2B complète l'alignement à l'équateur cellulaire pendant la métaphase(figure 2C, pointe de flèche jaune).
- Pour surveiller le moment mitotique, la fidélité mitotique et le destin cellulaire, continuez à suivre la cellule à travers des moments consécutifs afin d'identifier le temps de coordination à partir duquel la ségrégation chromosomique anaphase est apparente (figure 2C, tête de flèche blanche) et/ou où la décompaction de chromatine et la réforme de l'enveloppe nucléaire (comme indiqué par l'exclusion de la tubuline du noyau) se sont produites.
REMARQUE : Les perturbations dans l'assemblage de fuseau ou la progression mitotique peuvent être évaluées en fonction du temps requis pour obtenir un fuseau mitotique bipolaire et réaliser l'alignement complet de chromosome, ou pour accomplir la ségrégation de chromosome d'anaphase. - Visualisez RFP-H2B pour identifier les cellules de chaque population qui présentent des défauts mitotiques, y compris les chromosomes en retard et les ponts de chromatine pendant la ségrégation chromosomique anaphase.
REMARQUE : La fidélité mitotique compromise peut également entraîner des cellules filles multinuculées ou micronuculées et peut être visualisée dans les cellules post-sortie mitotique, comme dans la figure 3.
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Representative Results
Évaluation de la progression mitotique en présence de perturbations de fuseau
La régulation de la mise au point du pôle de fuseau est une étape essentielle dans la formation bipolaire appropriée de fuseau. Perturbation dans ce processus par des épuisements de protéine, inhibition de drogue, ou des changements dans la structure corrompue de fuseau de nombre centrosome et retardent ou arrêtent la progression mitotique10,11,12,13. Néanmoins, quelques perturbations retardent seulement transitoirement la formation de fuseau avec des cellules procédant finalement par mitose pour compléter la ségrégation de chromosome d'anaphase14. En l'absence d'approches de synchronisation cellulaire, qui peuvent elles-mêmes indirectement avoir un impact sur les processus mitotiques1,2, les cellules progressent par mitose asynchrone(figure 2C). L'utilisation de la RFP-H2B pour identifier la chromatine, les cellules mitotiques à chromatine compacte peuvent être mises en scène comme étant en proméaphase (celles avant l'alignement complet des métaphases : Figure 2C, pointes de flèche bleues), métaphase (alignement chromosomique complet : Figure 2 C, pointes de flèche jaunes) et anaphase (chromosomes ségrégués vers des pôles fuseaux : Figure 2C, pointes de flèche blanches). La capture de 5-8 coordonnées sur 4 h est suffisante pour suivre la progression d'au moins 50 cellules par mitose dans un état donné. Étudier la dynamique de l'assemblage du fuseau à la suite d'altérations du nombre centrosome et/ou de l'inhibition d'Aurora A kinase, un régulateur important du pôle de fuseau se concentrant14,15,16, 17, nous avons utilisé l'imagerie en accéléré cellulaire vivant des cellules humaines avec 2 centrosomes, ou ceux contenant des centrosomes surnuméraires. Les cellules ont été cultivées en présence ou en absence de l'inhibiteur de la kinase Aurora A avant le début de l'imagerie. Les cellules avec 2 centrosomes éprouvent la perturbation dans la progression mitotique une fois traitées avec l'inhibiteur d'aurore A kinase, mais sont finalement capables d'atteindre l'alignement de chromosome de métaphase (figure 2C,pointe de flèche jaune). En revanche, les cellules avec des centrosomes de 'gt;2 sont extrêmement sensibles à l'inhibition d'Aurora A et montrent une augmentation des cellules de prométaphase et une absence des cellules de métaphase, indiquant un retard dans l'assemblage de fuseau et la progression mitotique.
La figure 3 démontre que de telles approches d'imagerie en accéléré sont suffisantes pour surveiller à la fois l'assemblage du fuseau et la fidélité mitotique. En visualisant la tubuline-EGFP, on a observé que les cellules qui éprouvent la perturbation de fuseau (montrée ici en raison de la surduplication centrosome) subissent des changements dynamiques pendant que la mise au point de poteau de fuseau est réalisée et un fuseau mitotique bipolaire est formé en préparation pour division. En même temps que l'assemblage du fuseau, le mouvement chromosomique peut être visualisé avec RFP-H2B pour évaluer l'alignement des chromosomes et la fidélité à la ségrégation. Les cellules mitotiques qui éprouvent la multipolarité transitoire de fuseau sont sensibles aux erreurs d'attachement qui ont comme conséquence les chromosomes lassants pendant l'anaphase et forment des micronuclei dans la phase suivante de G1 du cycle de cellules. De tels défauts sont évidents avec ces approches vivantes de formation image de cellules.
Les changements dans la progression dynamique de la mitose modifient le moment mitotique et le destin des cellules mitotiques
Après la panne de l'enveloppe nucléaire, la formation du fuseau et le mouvement chromosomique peuvent être suivis à travers les étapes de la mitose pour évaluer la progression mitotique, la durée et le sort des cellules qui progressent en anaphase. L'amplification centrosome, une caractéristique commune dans beaucoup de types de cancer, est caractérisée par la présence des centrosomes supplémentaires et de la formation multipolaire defuseau 18,19,20. Comme les divisions multipolaires se traduisent par des cellules filles très anéuploides et probablement non viables, les cellules cancéreuses regroupent activement des centrosomes supplémentaires pour former un fuseau bipolaire et subir une division bipolaire5,20,21, 22,23,24. En utilisant des approches d'imagerie cellulaire en direct, nos résultats représentatifs montrent que les cellules ayant une teneur normale en centrosome sont capables de procéder à partir de la dégradation de l'enveloppe nucléaire par l'alignement des métaphases et l'encours d'anaphase pour atteindre une division bipolaire en moins de 30 minutes ( Figure 4 A,D,E). En présence de centrosomes supplémentaires, près de 50 % des cellules sont capables de surmonter un fuseau mitotique multipolaire transitoire et de former une broche bipolaire et une division cellulaire complète(figure 4C,D). Les cellules restantes sont incapables d'atteindre un fuseau bipolaire et, par conséquent, de sortir de la mitose par le biais d'une division multipolaire (Figure 4B,D). Indépendamment du fait que la bipolarité du fuseau soit atteinte, les cellules avec des centrosomes supplémentaires présentent une durée significativement accrue de mitose par rapport aux cellules avec 2 centrosomes, indiquant que la dynamique de la progression mitotique peut être modifiée même lorsque les changements dans résultats mitotiques ne sont pas apparents (figure 4E).
Figure 1 : Sélection des paramètres du microscope et de la caméra. (A) Représentation de la fenêtre pour sélectionner le cube de filtre objectif et approprié souhaité à l'aide d'un logiciel d'acquisition d'images. La sélection de l'objectif de grossissement 20x et du cube de filtre brightfield est montrée. (B) Les cellules de la plaque d'échantillon sont trouvées et mises au point à l'aide d'une microscopie de contraste de type brightfield ou de phase. (C) Représentation de la fenêtre pour définir les paramètres d'exposition pour chaque capture d'image. Le binning pixel peut être utilisé, si nécessaire, pour réduire le temps d'exposition par capture et minimiser les dommages aux cellules. La barre d'échelle est de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Capture et analyse d'images de la microscopie en accéléré. (A et B) Représentation de la fenêtre indiquant comment les paramètres d'acquisition d'images sont réglés à l'aide du logiciel d'acquisition d'images NIS Elements HCA. Ce logiciel permet l'imagerie multi-coordonnées et multi-puits au fil du temps. Chaque travail peut être modifié pour spécifier les puits et les coordonnées à capturer. (C) Délais uniques à partir de quatre conditions d'une expérience. RFP-H2B est utilisé pour suivre la chromatine. Le compactage et le positionnement de chromatine sont employés pour identifier différentes étapes de mitose : Prométhéaphase (compaction en l'absence de l'alignement de chromosome, pointe de flèche bleue), Metaphase (alignement complet de chromosome à l'équateur de cellules, pointe de flèche jaune), et Anaphase (suite à l'initiation de la ségrégation synchrone de chromosome, pointe de flèche blanche). La barre d'échelle est de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L'imagerie par laps usinvisualise les défauts de la fidélité mitotique. Les cellules contenant des centrosomes supplémentaires forment des fuseaux multipolaires et les regroupent souvent en un fuseau bipolaire avant de terminer la division cellulaire. Ici, une cellule entre dans la mitose avec sept pôles de fuseau distincts (astérisques blancs) qui, au fil du temps, sont regroupés en deux pôles principaux de fuseau. À ce stade, les chromosomes sont capables de s'aligner le long de l'équateur de fuseau, et la cellule procède à l'anaphase. La multipolarité transitoire a permis un mauvais attachement d'un seul chromosome. Cette erreur non résolue entraîne un chromosome à la traîne pendant l'anaphase qui devient incorporé dans un micronucleus dans une cellule fille (étiqueté avec une flèche). La chromatine est visualisée avec La DP-Histone 2B et les microtubules sont visualisés avec le 'tubulin-EGFP'. Les horodateurs dans chaque panneau indiquent les procès-verbaux en ce qui concerne la panne apparente de l'enveloppe nucléaire, comme en témoigne la détection de la tubuline à l'intérieur de la frontière nucléaire. La barre d'échelle est de 5 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les changements dans la progression dynamique de la mitose modifient le moment mitotique et le destin des cellules mitotiques. La DP-H2B, représentée en rouge, est utilisée pour suivre le mouvement de la chromatine et le FPG-tubulin-GFP, représenté en vert, est utilisé pour surveiller le numéro et l'organisation des poteaux centrosome/spindle. La perte de l'exclusion gFP-tubulin du noyau, en même temps que le compactage précoce de chromatine est une indication que l'enveloppe nucléaire s'est décomposée (NEB) en préparation pour la division des cellules mitotiques. L'exclusion nucléaire du GFP-tubulin est évidente à la sortie mitotique et à la réforme de l'enveloppe nucléaire. (A) Une cellule avec deux centrosomes forme un fuseau bipolaire et progresse à travers l'anaphase pour former deux cellules filles. (B et C) Les cellules avec des centrosomes supplémentaires entrent dans la mitose pour former un fuseau multipolaire. (B) Certaines de ces cellules avec des centrosomes supplémentaires retardent dans la mitose sans réaliser un fuseau bipolaire et progressent pour compléter l'anaphase multipolaire. (C) D'autres cellules avec des centrosomes supplémentaires présentent un retard transitoire dans la progression mitotique tandis qu'ils regroupent des centrosomes supplémentaires pour permettre l'anaphase bipolaire. (D) Les cellules avec des centrosomes supplémentaires sont capables de subir une division bipolaire environ 50% du temps, tandis que les cellules restantes avec des centrosomes supplémentaires subissent une division multipolaire. (E) Les cellules avec des centrosomes supplémentaires ont augmenté le timing mitotique indépendamment du destin mitotique éventuel (anaphase bipolaire ou multipolaire). La barre d'échelle est de 5 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La résolution temporelle fournie par l'imagerie en time-lapse permet la visualisation et l'évaluation des événements cellulaires séquentiels dans les cellules individuelles. Les approches qui font usage de la synchronisation cellulaire suivie de la collecte et de la fixation des cellules aux points de temps séquentiels sont limitées en ce sens que les comparaisons sont finalement faites entre les populations de cellules. Dans les contextes où la réponse cellulaire aux perturbations peut être non uniforme, ou où le processus visualisé est dynamique, l'imagerie en accéléré cellulaire vivant est mieux équipée pour suivre et analyser à la fois la dynamique des cellules individuelles, ainsi que l'hétérogénéité au sein d'une population cellulaire. De cette façon, l'imagerie en time-lapse est particulièrement utile dans la surveillance de la progression cellulaire à travers les étapes dynamiques de la mitose et d'évaluer comment les perturbations à cette progression ont finalement un impact sur la fidélité de la division cellulaire mitotique et le destin cellulaire ultérieur.
Bien qu'il existe un certain nombre d'avantages à l'imagerie cellulaire vivante, des défis importants sont associés qui doivent être considérés et atténués lorsque c'est possible. L'un des défis consiste à maintenir des conditions environnementales appropriées pour assurer la viabilité et la prolifération des cellules pendant l'imagerie. Pour ce faire, la configuration d'imagerie doit inclure une chambre environnementale qui régule à la fois la température et le CO2. Alternativement, les cellules peuvent être représentées à court terme avec seulement un régulation de la température si elle est effectuée dans une chambre fermée. Dans les deux cas, l'utilisation d'une table antivibration et/ou d'approches matérielles pour atténuer les fluctuations de mise au point axiale (p. ex., la mise au point parfaite de Nikon) devrait être utilisée pour maintenir la mise au point des plaques pendant toute la durée de l'expérience. Une deuxième préoccupation importante avec l'imagerie cellulaire vivante est le potentiel de photodamage et de photoblanchiment. Le photoblanchiment est une préoccupation où le fluorophore représenté diminue graduellement l'intensité de la fluorescence au fur et à mesure que l'imagerie progresse. Cependant, l'exposition à la lumière d'excitation de haute intensité qui a comme conséquence le photoblanchiment est également toxique aux cellules et le soin doit être fait pour réduire l'exposition de cellules en diminuant des temps d'exposition, des intervalles d'acquisition d'image, et la durée totale de la séquence d'imagerie 25. Les conséquences de ne pas optimiser les conditions d'imagerie pour minimiser la phototoxicité peuvent inclure la génération de dommages à l'ADN et d'autres changements cellulaires qui peuvent à leur tour compromettre l'interprétation et la compréhension de l'expérience. Si la viabilité des cellules devient un problème avec l'imagerie à long terme, des efforts devraient être faits pour utiliser le binning de pixel (pour permettre des expositions plus courtes) et augmenter la durée entre les captures d'image suivantes. Une autre préoccupation est que l'étiquette fluorescente peut modifier le comportement de la protéine à laquelle il est fusionné, ou que l'intégration de la construction de l'expression virale dans le génome peut elle-même avoir un impact sur le comportement cellulaire. Pour tenir compte de la possibilité que l'ajout d'une étiquette fluorescente puisse avoir un impact sur la fonction protéique, une évaluation de la fonction protéique après l'ajout d'une étiquette fluorescente terminale N ou C et une comparaison avec la fonction protéique non étiquetée sont nécessaires. Pour déterminer si des effets indésirables sur le comportement cellulaire surviennent en raison de la perturbation du locus génomique dans lequel la construction virale a été intégrée, plusieurs clones de cellules uniques devraient être dérivés, par rapport aux cellules qui n'ont pas la protéine étiquetée, et testés pour surveiller que la forme physique cellulaire et la progression mitotique ne sont pas perturbées. Alternativement, les effets hors cible de l'intégration aléatoire de la construction d'expression virale peuvent être atténués par l'intégration ciblée de la protéine de fusion dans le locus endogène, ou d'autres régions connues du génome, utilisant des approches BASÉES sur CRISPR.
Les approches visant à identifier et à caractériser les principaux régulateurs de la progression mitotique se sont largement appuyées sur l'imagerie cellulaire fixe. Les régulateurs mitotiques identifiés de cette façon ont par la suite été exploités dans des thérapies ciblant les cellules cancéreuses qui prolifèrent rapidement7,8,9. Cependant, les drogues antimitotic ne exécutent pas toujours uniformément dans différents cancers et dans beaucoup de cas perspicacité dans les phénotypes mitotiques qui précèdent les approches chimiothérapeutiques réussies ou infructueuses restent peu claires. L'imagerie en accéléré cellulaire vivant pour suivre les cellules mitotiques en présence et l'absence de médicaments perturbateurs de fuseau a le potentiel de fournir les connaissances nécessaires pour identifier les modulateurs les plus susceptibles d'entraîner des mitoses catastrophiques et la viabilité compromise de cellules cancéreuses avec un impact minimal sur les cellules normales.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
DLM est soutenu par un GRFP NSF. ALM bénéficie d'un financement du Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
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