Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung
Summary
Unsere Studie konzentriert sich auf die Auswirkungen der Leptin-Signalisierung im Karotiskörper (CB) auf die hypoxische Beatmungsreaktion (HVR). Wir führten “Verlust der Funktion” Experimente zur Messung der Wirkung von Leptin auf HVR nach CB-Denervation und “Gain of Function” Experimente zur Messung von HVR nach Überexpression des Leptinrezeptors in CB.
Abstract
Ein mit Adipozyten hergestelltes Hormon Leptin ist ein starkes Atemstimulans, das eine wichtige Rolle bei der Verteidigung der Atemfunktion bei Fettleibigkeit spielen kann. Die Karotiskörper (CB), ein Schlüsselorgan der peripheren hypoxischen Empfindlichkeit, drücken die lange funktionelle Isoform des Leptinrezeptors (LepRb) aus, aber die Rolle der Leptin-Signalisierung bei der Kontrolle der Atmung ist noch nicht vollständig geklärt. Wir untersuchten die hypoxische beatmungstische Reaktion (HVR) (1) bei C57BL/6J-Mäusen vor und nach der Leptin-Infusion an der Basislinie und nach der CB-Denervation; (2) bei LepRb-mangelhaften übergewichtigen db/db-Mäusen zu Beginn und nach LepRb Überexpression in CBs. Bei C57BL/6J-Mäusen wurde Leptin-erhöhter HVR und die Wirkung von Leptin auf HVR durch CB-Denervation abgeschafft. Bei db/db-Mäusen erweiterte lepRb-Expression in CB den HVR. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass Leptin in CB wirkt, um die Reaktionen auf Hypoxie zu verstärken.
Introduction
Ein Adipozyten produziert Hormon Leptin wirkt im Hypothalamus, um die Nahrungsaufnahme zu unterdrücken und die Stoffwechselrate zu erhöhen. Studien in unserem Labor1,2 und von anderen Forschern3,4 zeigten, dass Leptin die hyperkapnische Beatmungsreaktion (HVR) erhöht, die Adipositas-Hypoventilation bei Leptin verhindert Mangelanung von Adipositas. Jedoch, die Mehrheit der übergewichtigen Personen haben hohe Plasma-Leptin-Spiegel und zeigen Resistenz gegen die metabolischen und atmungsischen Wirkungen des Hormons5,6,7,8. Die Resistenz gegen Leptin ist multifaktoriell, aber die begrenzte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) gegen Leptin spielt eine wichtige Rolle. Wir schlagen vor, dass Leptin unterhalb von BBB in einem Schlüsselorgan der peripheren hypoxischen Empfindlichkeit wirkt, die Karotiskörper (CB), um die Atmung bei übergewichtigen Personen zu verteidigen. CBs drücken die lange funktionelle Isoform des Leptinrezeptors, LepRb, aber die Rolle von CB bei den atmungseren Wirkungen von Leptin wurde nicht ausreichend aufgeklärt9,10.
Das Ziel unserer Methode war es, die Wirkung der Leptin-Signalisierung im CB auf HVR zu untersuchen. Unsere Begründung war, (a) Denkausnehmen von Funktionsexperimenten bei Mäusen mit intakten Karotiskörpern und denervierten Karotiskörpern durchzuführen, gefolgt von HVR-Messungen; b) Verstärkung von Funktionsexperimenten an db/db-Mäusen ohne LepRb, bei denen wir den HVR zu Beginn und nach Expression von LepRb ausschließlich in CB gemessen haben. Der Vorteil unserer Techniken war, dass wir alle unsere Experimente an hemmungslosen ungeästheten Mäusen während des Schlafes und der Wachheit durchführten. Frühere Forscher führten ihre Experimente entweder unter Anästhesie9 durch oder maßen die Auswirkungen von Leptin während des Schlafes10nicht. Darüber hinaus ist unsere Studie die erste, die einen einzigartigen Funktionsgewinnansatz mit selektiverLepR-b-Expression in CB verwendet, die oben beschrieben wurde.
Im breiten Kontext kann unser Ansatz auf andere Rezeptoren verallgemeinert werden, die in CB ausgedrückt werden, und ihre Rolle bei der hypoxischen Empfindlichkeit. Die Ermittler können einen Liganden zu einem Rezeptor von Interesse einlüfühlt und den HVR zu Beginn und nach CB-Denervation messen. Als komplementärer Ansatz kann ein Interessenrezeptor in CB-Messungen überexprimiert werden und HVR-Messungen können vor und nach der Überexpression mit unserer in diesem Manuskript beschriebenen Technologie durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Schwerpunkt unserer Studie lag auf der Untersuchung der atmungseren Wirkungen der Leptin-Signalisierung im CB. Mehrere Protokolle wurden entwickelt, um die Rolle von Leptin in einer mechanistischen Weise zu bewerten. Zunächst wurde der spezifische Beitrag von CB zum HVR durch sorgfältige Quantifizierung des HVR während der ersten 2 min hypoxischer Exposition analysiert. Zweitens wurde die Relevanz von CB für die Leptin-vermittelte Up-Regulierung der Kontrolle der Atmung durch zwei sich ergänzende Ansätze unters…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
Referências
- O’donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
