Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración
Summary
Nuestro estudio se centra en los efectos de la señalización de la leptina en el cuerpo carótido (CB) en la respuesta ventilatoria hipoxica (HVR). Realizamos experimentos de “pérdida de función” que miden el efecto de la leptina en la rred hVR después de experimentos de denervación y “ganancia de función” que miden la HVR después de una sobreexpresión del receptor de leptina en CB.
Abstract
Una leptina hormonal producida por adipocitos es un potente estimulante respiratorio, que puede desempeñar un papel importante en la defensa de la función respiratoria en la obesidad. Los cuerpos carótidos (CB), un órgano clave de sensibilidad hipóxitica periférica, expresan la larga isoforma funcional del receptor de leptina (LepRb), pero el papel de la señalización de la leptina en el control de la respiración no ha sido completamente aclarado. Examinamos la respuesta ventilatoria hipoxica (HVR) (1) en ratones C57BL/6J antes y después de la perfusión de leptina al inicio y después de la denervación del CB; (2) en ratones db/db con deficiencia de LepRben línea de base y después de la sobreexpresión de LepRb en los C. En ratones C57BL/6J, el aumento de la leptina en la HVR y los efectos de la leptina en la RVR fueron abolidos por la denervación del CB. En ratones db/db, la expresión LepRb en CB aumentó el HVR. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la leptina actúa en CB para aumentar las respuestas a la hipoxia.
Introduction
Un adipocitos produjo leptina hormona actúa en el hipotálamo para suprimir la ingesta de alimentos y aumentar la tasa metabólica. Los estudios realizados en nuestro laboratorio1,2 y por otros investigadores3,4 mostraron que la leptina aumenta la respuesta ventilatoria hipercapnica (HVR) previniendo la hipoventilación por obesidad en la leptina obesidad deficiente. Sin embargo, la mayoría de los individuos obesenes tienen altos niveles de leptina plasmática y demuestran resistencia a los efectos metabólicos y respiratorios de la hormona5,6,7,8. La resistencia a la leptina es multifactorial, pero la permeabilidad limitada de la barrera hematoencefálica (BBB) a la leptina juega un papel importante. Proponemos que la leptina actúe por debajo de BBB en un órgano clave de sensibilidad hipóxica periférica, los cuerpos carótidos (CB), para defender la respiración en individuos obesos. Los OC expresan la larga isoforma funcional del receptor de leptina, LepRb, pero el papel de LA CB en los efectos respiratorios de la leptina no ha sido suficientemente aclarado9,10.
El objetivo de nuestro método era examinar el efecto de la señalización de la leptina en el CB en el HVR. Nuestra justificación era realizar (a) la pérdida de experimentos de función infundiendo leptina en ratones con cuerpos carótidos intactos y cuerpos carótidos denervados seguidos de mediciones de HVR; (b) ganancia de experimentos de función en ratones db/db carentes de LepRb, en el que medimos el HVR al inicio y después de la expresión de LepRb exclusivamente en CB. La ventaja de nuestras técnicas fue que realizamos todos nuestros experimentos en ratones sin restricciones sin restricciones durante el sueño y la vigilia. Investigadores anteriores realizaron sus experimentos bajo anestesia9 o no midieron los efectos de la leptina durante el sueño10. Además, nuestro estudio es el primero en utilizar un enfoque único de ganancia de función con la expresión lepRb selectiva en CB descrito anteriormente.
En el contexto amplio, nuestro enfoque puede generalizarse a otros receptores expresados en CB y su papel en la sensibilidad hipoxica. Los investigadores pueden infundir un ligando a un receptor de interés y medir el HVR al inicio y después de la denervación del CB. Como enfoque complementario, un receptor de interés se puede sobreexpresar en las mediciones de CB y HVR se puede realizar antes y después de la sobreexpresión utilizando nuestra tecnología descrita en este manuscrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque principal de nuestro estudio fue examinar los efectos respiratorios de la señalización de la leptina en el CB. Se han desarrollado varios protocolos para evaluar el papel de la leptina de manera mecanicista. En primer lugar, se analizó la contribución específica de CB al HVR mediante una cuantificación cuidadosa de la HVR durante los primeros 2 minutos de exposición hipoxica. En segundo lugar, la pertinencia de la cooperación técnica en la regulación ascendente mediada por la leptina del control de l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
Referências
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