Abordagem experimental para examinar a sinalização de leptina nos corpos carótidas e seus efeitos sobre o controle da respiração
Summary
Nosso estudo se concentra nos efeitos da sinalização de leptina no corpo carótida (Cb) na resposta ventilatória hipóxico (HVR). Realizamos experimentos de “perda de função” medindo o efeito da leptina no HVR após a denervação do CB e experimentos de “ganho de função” medindo HVR após superexpressão do receptor de leptina na Cb.
Abstract
Uma leptina hormonal produzida por adiócito é um estimulante respiratório potente, que pode desempenhar um papel importante na defesa da função respiratória na obesidade. Os corpos carótidas (CB), um órgão-chave da sensibilidade hipóxico periférica, expressam a longa isoforme funcional do receptor de leptina (LepRb),mas o papel da sinalização de leptina no controle da respiração não foi totalmente elucidado. Examinamos a resposta ventilatória hipóxico (HVR) (1) em camundongos C57BL/6J antes e depois da infusão de leptina na linha de base e após a denervação do CB; (2) em LepRb-deficientes camundongos obesos db/db na linha de base e após a superexpressão leprb em CBs. Em camundongos C57BL/6J, a leptina aumentou o HVR e os efeitos da leptina no HVR foram abolidos pela denervação do CB. Em camundongos db/db, a expressão de LepRb em CB aumentou o HVR. Portanto, concluímos que a leptina atua na Cb para aumentar as respostas à hipóxia.
Introduction
Um adipócito produzido hormônio leptina atua no hipotálamo para suprimir a ingestão de alimentos e aumentar a taxa metabólica. Estudos realizados em nosso laboratório1,2 e por outros investigadores3,4 mostraram que a leptina aumenta a resposta hipercapônica ventilatória (HVR) prevenindo a hipoventilação da obesidade na leptina obesidade deficiente. No entanto, a maioria dos indivíduos obesos têm altos níveis de leptina plasmática e demonstram resistência aos efeitos metabólicos e respiratórios do hormônio5,6,7,8. A resistência à leptina é multifatorial, mas a permeabilidade limitada da barreira sangue-cérebro (BBB) à leptina desempenha um papel importante. Propomos que a leptina aja abaixo do BBB em um órgão-chave de sensibilidade hipóxico periférica, os corpos carótidas (Cb), para defender a respiração em indivíduos obesos. CBs expressar a longa isoforme funcional do receptor de leptina, LepRb, mas o papel da Cb em efeitos respiratórios da leptina não foi suficientemente elucidado9,10.
O objetivo do nosso método era examinar o efeito da sinalização de leptina no CB no HVR. Nossa lógica era realizar (a) perda de experimentos de função infundindo leptina em camundongos com corpos carótidos intactos e corpos carótidos denervatados seguidos por medições de HVR; (b) ganho de experimentos de função em camundongos db/db sem LepRb,no qual medimos o HVR na linha de base e após a expressão de LepRb exclusivamente em CB. A vantagem de nossas técnicas era que nós executamos todas nossas experiências em ratos desenfreados desenfreados durante o sono e o wakefulness. Investigadores anteriores realizaram seus experimentos anestesia9 ou não mediram os efeitos da leptina durante o sono10. Além disso, nosso estudo é o primeiro a utilizar um ganho único de abordagem de função com expressão seletiva de LepRb em Cb descrita acima.
No contexto amplo, nossa abordagem pode ser generalizada para outros receptores expressos na Cb e seu papel na sensibilidade hipóxico. Os investigadores podem infundir um ligand a um receptor do interesse e medir o HVR na linha de base e após o denervation do CB. Como uma abordagem complementar, um receptor de interesse pode ser superexpresso nas medições de CB e HVR pode ser realizado antes e depois da superexpressão usando nossa tecnologia descrita neste manuscrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
O foco principal do nosso estudo foi examinar os efeitos respiratórios da sinalização de leptina no Cb. Vários protocolos foram desenvolvidos para avaliar o papel da leptina de forma mecanicista. Em primeiro lugar, a contribuição específica da TCc para o HVR foi analisada por quantificação cuidadosa do HVR durante os primeiros 2 min de exposição hipóxico. Em segundo lugar, a relevância da Cb na regulação up mediada pela leptina do controle da respiração foi examinada por duas abordagens complementares. E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
Referências
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