Experimentell metod för att undersöka leptin signalering i halspulsådern organ och dess effekter på kontroll av andning
Summary
Vår studie fokuserar på effekterna av leptin signalering i halspulsådern kroppen (CB) på hypoxisk andningshjälp svar (HVR). Vi utförde “förlust av funktion” experiment mäta effekten av leptin på HVR efter CB denervering och “vinst av funktion” experiment mäta HVR efter överuttryck av leptin receptorn i CB.
Abstract
Ett adipocyte-producerat hormon leptin är en potent respiratorisk stimulerande, som kan spela en viktig roll för att försvara andningsfunktionen hos fetma. Den halspulsådern organ (CB), ett nyckelorgan i perifer hypoxisk känslighet, uttrycka den långa funktionella isoform av Leptin receptor (LepRb) men rollen av leptin signalering i kontroll av andning har inte helt klarlagd. Vi undersökte den hypoxiska andningshjälp responsen (HVR) (1) hos C57BL/6j möss före och efter infusion med leptin vid baseline och efter CB denervation; (2) i leprb-bristfällig feta db/DB möss vid baseline och efter Leprb överuttryck i CBs. I C57BL/6J möss ökade leptin HVR och effekterna av leptin på HVR avskaffades av CB denervation. I db/DB- möss har leprb -uttrycket i CB förstärkt HVR. Därför, vi drar slutsatsen att leptin agerar i CB att öka Svaren till hypoxi.
Introduction
En fettceller produceras hormon leptin verkar i hypotalamus att undertrycka födointag och öka ämnesomsättningen. Studier utförda i vårt laboratorium1,2 och av andra utredare3,4 visade att leptin ökar hyperkapnisk andningshjälp respons (HVR) för att förhindra obesitas hypoventilation i Leptin brist på fetma. Emellertid, en majoritet av överviktiga individer har höga halter av leptin i plasma och uppvisar resistens mot de metabola och respiratoriska effekterna av hormonet5,6,7,8. Resistens mot leptin är multifaktoriell, men begränsad permeabilitet av blod-hjärnbarriären (BBB) till leptin spelar en viktig roll. Vi föreslår att leptin verkar under BBB i ett nyckelorgan av perifer hypoxisk känslighet, halspulsådern organ (CB), att försvara andning hos överviktiga individer. CBs uttrycker den långa funktionella isoformen av Leptin receptor, leprb, men rollen av CB i respiratoriska effekter av leptin har inte varit tillräckligt klarlagd9,10.
Målet med vår metod var att undersöka effekten av leptin signalering i CB på HVR. Vår motivering var att utföra (a) förlust av funktions experiment infusion leptin hos möss med intakta karotikroppar och denervated halspulsådern organ följt av HVR mätningar; b) vinst av funktions experiment i db/DB- möss som saknar leprb, där vi mätte HVR vid baseline och efter uttryck av LEPRb uteslutande i CB. Fördelen med vår teknik var att vi utförde alla våra experiment i ohämmade tre möss under sömnen och vakenhet. Tidigare utredare utförde antingen sina experiment under anestesi9 eller inte mäta effekterna av leptin under sömn10. Dessutom är vår studie den första att använda en unik vinst av funktionssätt med selektiv LepRb uttryck i CB som beskrivs ovan.
I det breda sammanhanget, vår metod kan generaliseras till andra receptorer uttryckta i CB och deras roll i hypoxisk känslighet. Utredare kan ingjuta en ligand till en receptor av intresse och mäta HVR vid baseline och efter CB denervation. Som en kompletterande metod kan en receptor av intresse överuttryckas i CB och HVR mätningar kan utföras före och efter överuttryck med hjälp av vår teknik som beskrivs i detta manuskript.
Protocol
Representative Results
Discussion
Huvudfokus i vår studie var att undersöka luftvägs effekter av leptin signalering i CB. Flera protokoll har utvecklats för att bedöma rollen av leptin på ett mekanistiskt sätt. För det första analyserades det specifika bidraget från CB till HVR genom noggrann kvantifiering av HVR under den första 2 min av hypoxisk exponering. För det andra, relevansen av CB i Leptin-medierad upp-reglering av andningskontroll undersöktes av två kompletterande metoder. I Lean Wild-Type möss med låga Leptin nivåer, var HVR …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
Referências
- O’donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
