Summary
यहां हम ग्लूकोज के एक कौडल नस इंजेक्शन के माध्यम से दो पैराबायोंट्स के साझा रक्त परिसंचरण की सफल स्थापना का पता लगाने की एक नई विधि का वर्णन करते हैं, जो न्यूनतम क्षति का कारण बनता है और पैराबायोंट्स के लिए घातक नहीं है।
Abstract
पैराबायोसिस शरीर की देशांतर धुरी के साथ दो समानांतर जानवरों के संयोजन के लिए शल्य चिकित्सा के लिए एक प्रयोगात्मक विधि है। हम ग्लूकोज के एक कौडल नस इंजेक्शन द्वारा पैराबायोंट्स में रक्त कल्पना की सफल स्थापना का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पैराबायोटिक चूहों का निर्माण किया गया था। ग्लूकोज पूंछ नस के माध्यम से दाता माउस में इंजेक्शन था, और रक्त ग्लूकोज के स्तर के उतार चढ़ाव दोनों चूहों में अलग समय बिंदुओं पर एक रक्त ग्लूकोमीटर का उपयोग कर मापा गया था । हमारे परिणामों से पता चला है कि ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद, दाता चूहों में रक्त ग्लूकोज का स्तर 1 मिन के बाद तेजी से बढ़ा और उसके बाद धीरे-धीरे कम हो गया। इस बीच, प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त ग्लूकोज का स्तर इंजेक्शन के बाद 15 min नुकीला । इसी तरह के परिणाम इवांस ब्लू के साथ प्राप्त किए गए थे, ग्लूकोज के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया । रक्त शर्करा के स्तर के समकालिक उतार-चढ़ाव से पता चलता है कि दोनों चूहों के बीच रक्त प्रवाह सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था।
Introduction
पैराबायोसिस एक मॉडलिंग पद्धति है जिसमें दो जीवित जीवों को शल्य चिकित्सा से एक साथ मिलाया जाता है और एक साझा संचार प्रणाली के साथ एक एकल शारीरिक प्रणाली के रूप में विकसित किया जाता है1। इस तरह के मॉडलव्यापक रूप से लाभ है कि एक ही व्यक्ति द्वारा उत्पादित पदार्थों साझा संचार प्रणाली के माध्यम से एक ही समय में दोनों जानवरों पर कार्य कर सकते है के कारण शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । 1800 के दशक के मध्य से जब पॉल बर्ट2द्वारा पैराबायोटिक प्रयोगों का बीड़ा उठाया गया था, पैराबायोटिक मॉडल के निर्माण के तरीके मानकीकृत हो गए हैं। हालांकि, रक्त कल्पना की सफल स्थापना की पुष्टि करने के लिए एक सीधा और सुविधाजनक तरीका गायब हो गया है । यह बताया गया है कि क्रॉस-सर्कुलेशन का सफलतापूर्वक मूल्यांकन किया जा सकता है, जो एक माइक्रोप्लेट रीडर3के साथ दोनों पैराबायोंट्स के रक्त में इवांस ब्लू के अवशोषण की माप के बाद पैराबायोंट्स में से एक में 0.5% इवांस ब्लू डाइ इंजेक्शन लगाकर। एक अन्य विधि के लिए एक विशिष्ट माउस नस्ल की आवश्यकता होती है जिसमें सीडी45.1+और सीडी45.2+- प्रत्येक पैराबायोंट में मोनोसाइट्स लेबल होते हैं। इसके बाद सेल साइटोमेट्री का उपयोग तिल्ली या रक्त4से मोनोसाइट्स में दो मार्कर की आवृत्ति को मापकर रक्त की कल्पना का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। हालांकि, ये विधियां अक्सर जानवरों के लिए घातक या बोझिल होती हैं, और पैराबायोटिक मॉडल के त्वरित और विश्वसनीय सत्यापन के लिए एक सुरक्षित और सरल तरीका अत्यधिक वांछनीय है। इस अध्ययन में, हमने इस उद्देश्य के लिए एक नई विधि स्थापित की, जिसे पैराबायोसिस के माउस मॉडल में मान्य किया गया था। पूंछ की नस से तैयार रक्त नमूनों में ग्लूकोज एकाग्रता को ग्लूकोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है, और दाता और प्राप्तकर्ता चूहों में ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन का पैटर्न परिसंचरण कल्पना का संकेत माना जाता है। हमने इस विधि को "ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि" नाम दिया। इस सत्यापन विधि का अनुप्रयोग चूहों तक सीमित नहीं है, लेकिन ग्लूकोज चयापचय के गंभीर डिस्रेगुलेशन वाले लोगों को छोड़कर विविध रोग मॉडलों तक बढ़ाया जा सकता है। प्रक्रिया सरल, समय की बचत, और सुरक्षित है।
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Protocol
हार्बिन मेडिकल यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा जानवरों और उनकी देखभाल से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई ।
नोट: विधि के लिए आवश्यक उपकरण और उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं।
1. सामग्री और जानवरों की तैयारी
- आदेश C57BL/6 एक मानक प्रयोगशाला पशु आपूर्तिकर्ता से 20 ग्राम-25 ग्राम के बीच वजन के साथ पुरुष चूहों ।
- 12 घंटे प्रकाश के चक्र में चूहों को घर: 12 घंटे 24−26 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरा पानी और भोजन के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग के साथ।
2. पैराबायोसिस
- 0.1 mL/10 ग्राम की एकाग्रता पर 20 ग्राम/एल 2,2,2-ट्राइब्रोमोथेनॉल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
- सूखी आंखों को रोकने के लिए क्यू-टिप के साथ नेत्र मलहम लगाएं।
- पैराबायोसिस प्रक्रिया को पहले वर्णित5के रूप में करें।
- चूहों को स्पीन स्थिति में रखें। एक माउस के बाईं ओर और दूसरे माउस के दाईं ओर कोहनी के ऊपर लगभग 1 सेमी से शुरू होकर एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ घुटने के नीचे 1 सेमी तक अच्छी तरह से शेव करें। मुंडा त्वचा पर फर को पूरी तरह से साफ करने के लिए डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें।
- मुंडा क्षेत्रों को आयोडोहोर से पोंछ लें। चूहों को बाँझ पैड से ढके गर्म पैड पर रखें।
- प्रत्येक जानवर की मुंडा पक्ष पर तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके कोहनी के ऊपर 0.5 सेमी से लेकर घुटने के जोड़ के नीचे 0.5 सेमी तक शुरू होने वाले देशीयत्वचा चीरों को बनाएं।
- चीरा के बाद चमड़े के नीचे प्रावरणी से त्वचा को धीरे से अलग करें।
- पैराबायोंट के ओलेक्रैन और घुटने को 3-0 सीवन से कनेक्ट करें।
- एक निरंतर 5-0 सीवन के साथ मुंडा त्वचा टांका।
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक माउस को 0.9% नैसीएल का 0.5 मिलील इंजेक्ट करें।
- दर्द से राहत पाने के लिए प्रत्येक माउस को इंट्रामस्कुल (10 मिलीग्राम/25 ग्राम/दिन) इंट्रामस्कुलर इंजेक्ट करें।
3. परिसंचरण कल्पना का सत्यापन
- ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि
नोट: पैराबायोसिस सर्जरी के बाद 10वें दिन ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि (कोई उपवास नहीं) का उपयोग करके पैराबायोंट्स के बीच परिसंचरण कल्पना के सफल निर्माण को सत्यापित करें।- 0.1 mL/10 ग्राम की एकाग्रता पर प्रत्येक माउस को 20 ग्राम/एल 2,2,2-ट्राइब्रोमोथेनॉल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पैराबायोंट्स को एनेस्थेटाइज करें।
- एक वेनस विजुअल-माउस टेल फिक्सेटर में दाता चूहों को ठीक करें।
- पूंछ को साफ करने और रक्त वाहिकाओं को फैलाने के लिए 70−75% अल्कोहल में भिगोई गई कपास की गेंद के साथ पैराबायोंट की पूंछ में से एक के पार्श्व में कौडल नसों को रगड़ें।
- दाहिने हाथ में ग्लूकोज युक्त 1.0 मिलीएल सिरिंज पकड़ें और सुई को नस (15 डिग्री से कम) के समानांतर रखें।
- पूंछ टिप से लगभग 2−4 सेमी की स्थिति में सुई डालें।
- 10 एस के भीतर दाता में ग्लूकोज (१.२ ग्राम/किलो) के १०० μL इंजेक्ट करें ।
नोट: दाता शब्द पूंछ की नस के माध्यम से ग्लूकोज इंजेक्शन प्राप्त करने वाले पैराबायोंट को संदर्भित करता है। प्राप्तकर्ता अन्य पैराबायोंट है, जिसे सीधे ग्लूकोज प्राप्त नहीं होता है। - आयोडोहोर के साथ पाद पसोर्ट साफ करें। एक कैंची के साथ दाता और प्राप्तकर्ता चूहों के पैर की उंगलियों को काट लें और ग्लूकोज के इंजेक्शन (1 मिन, 5 मिन, 10 मिन, 15 मिन, 20 मिन, 30 मिन, 40 मिन, 50 मिन, और 60 मिन) के इंजेक्शन के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर रक्त की एक बूंद एकत्र करें। अधिक नुकसान से बचने के लिए प्रत्येक संग्रह समय बिंदु पर रक्त का थक्का हटा दें।
नोट: एकत्र रक्त की मात्रा एक परीक्षण के लिए 10-25 उल था, और कुल में 90-225 उल । - ग्लूकोज स्तर का पता लगाने के लिए ग्लूकोमीटर टेस्ट स्ट्रिप्स के केंद्र में रक्त ड्रिप करें।
- एक सकारात्मक नियंत्रण3के रूप में इवान के नीले काउंटरदाग का प्रयोग करें ।
- 0.5% इवान के नीले काउंटरदाग इंट्रापेरिटोनी लीरेकोनली से 200 माइक्रोन को दाता माउस में इंजेक्ट करें।
- 2 घंटे बाद, 0.2 mL/10 ग्राम की एकाग्रता पर प्रत्येक माउस को 20 ग्राम/एल 2,2,2-ट्राइब्रोमोथेनॉल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पैराबायोंट्स को इच्छामृत्यु दें, और कार्डियक पंचर द्वारा दोनों पैराबायोंट्स से रक्त एकत्र करें।
- 15 मिन के लिए 916 x ग्राम पर रक्त के नमूने को सेंट्रलाइज किया।
- अधिनेता से सीरम लीजिए।
- 1:50 पर 0.9% NaCl के साथ सीरम पतला।
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 620 एनएम पर पतला सीरम नमूनों के अवशोषण को मापें।
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Representative Results
छह डोनर चूहों में, रक्त शर्करा का स्तर तेजी से पूंछ की नस के माध्यम से ग्लूकोज के १०० माइक्रोन (१.२ ग्राम/किलो) के इंजेक्शन के बाद 1 न्यूनतम के एक औसत पर २६.५ μmol/L (१७३% वृद्धि) के लिए वृद्धि हुई है और फिर धीरे से ६० मिन पर १३.३ μmol/L के लिए कम हो गया । प्राप्तकर्ता चूहों में, इंजेक्शन के बाद रक्त ग्लूकोज धीरे-धीरे बढ़ जाता है और 15 न्यूनतम (47% वृद्धि, 12.2 μmol/L) पर पहले चरम स्तर पर पहुंच गया। उपरोक्त परिणामों के आधार पर, परिसंचरण कल्पना के लिए मानक इस प्रकार निर्धारित किया गया था: 1) ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद 1 मिनट के भीतर दाता चूहों में रक्त ग्लूकोज के स्तर (न्यूनतम 100% वृद्धि या >20 μmol/L) में तेजी से वृद्धि, और 2) इंजेक्शन के बाद प्राप्तकर्ता चूहों 15 मिनट में रक्त ग्लूकोज के स्तर में एक महत्वपूर्ण वृद्धि (न्यूनतम 37% वृद्धि)(चित्र ा 1)।
पैराबायोंट्स के सीरम में इवांस ब्लू डाये की एकाग्रता ने परिसंचरण कल्पना(चित्र ा 2)के सफल निर्माण का भी संकेत दिया। हमने 2,2,2-ट्राइब्रोमोनॉल (20 ग्राम/एल) के 5 किलोल का उपयोग करके रक्त ग्लूकोज माप के बाद पैराबायोंट्स को इच्छामृत्यु दी। पैराबायोंट्स के बीच चमड़े के संवहनी जंक्शनों को स्पष्ट रूप से देखा गया था(चित्रा 3)।
सप्लीमेंट्री फिगर 1 से पता चलता है कि डोनर चूहों में ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद एक महत्वपूर्ण ब्लड ग्लूकोज लेवल 1 मिन बढ़ गया था, जबकि प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त ग्लूकोज स्तर को ऊंचा नहीं किया गया था, जिसने दिखा दिया कि पैराबायोट्स में परिसंचरण कल्पनाको पैराबायोसिस सर्जरी के 1 दिन बाद सफलतापूर्वक स्थापित नहीं किया गया था । इसी तरह, प्राप्तकर्ता चूहों में रक्त ओडी स्तर दाता चूहों(अनुपूरक चित्रा 2)के रूप में ऊंचा नहीं था।
ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि के परिणामों के आधार पर, हमने पाया कि पैराबायोंट्स के दो जोड़े पैराबायोसिस सर्जरी के 15 दिन बाद रक्त कल्पना स्थापित नहीं करते थे। जैसा कि पूरक तालिका 1में दिखाया गया है, दो प्राप्तकर्ता चूहों को दाता चूहों में ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद 60 मिनट के भीतर रक्त शर्करा का स्तर नहीं था। दो प्राप्तकर्ताओं में इवांस ब्लू की रक्त एकाग्रता को भी ऊंचा नहीं किया गया था(अनुपूरक तालिका 2),जिसने यह दर्शाया कि ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि इवांस ब्लू विधि के रूप में संवेदनशील थी।
इसके अलावा, इंसुलिन मेटाबोलिज्म पर इंजेक्शन ग्लूकोज के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने चूहों में ग्लूकोज (1.2 ग्राम/किलो) के 100 माइक्रोन के इंजेक्शन के बाद रक्त इंसुलिन स्तर 1 एच और 3 एच का पता लगाया(पूरक चित्रा 3)। रक्त इंसुलिन का स्तर उल्लेखनीय ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद 1 घंटे कम हो गया था क्योंकि जल्दी से ग्लूकोज में वृद्धि हुई है और 3 घंटे में सामांय स्तर पर बरामद किया । इन परिणामों ने दिखा दिया कि इंसुलिन चयापचय पर हमने इंजेक्शन लगाए गए ग्लूकोज के प्रभाव को बहाल किया गया था।
चित्रा 1: कौडल नस के माध्यम से ग्लूकोज के इंजेक्शन के बाद पैराबायोंट्स में रक्त ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन। (ए)दाता चूहों का रक्त ग्लूकोज स्तर। (ख)प्राप्तकर्ता चूहों का रक्त ग्लूकोज स्तर (एन = 6)। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया है । * पी एंड एलटी; ०.०५, * पी & ०.०१, * * पी & ०.००१ बनाम 0 मिन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मापा पैराबायोंट्स के सीरम नमूनों में इवांस नीले की एकाग्रता। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ***पी एंड एलटी; 0.001 (एन = 6)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: पैराबायोंट्स के बीच कनेक्टेड त्वचा में चमड़े के नीचे वाले वासोगैंगलायंस की पीढ़ी। बाएं: पैराबायोसिस चूहों की प्रतिनिधि छवि। सही: पैराबायोंट्स के बीच चमड़े के नीचे वाले वासोगैंगलियन की एक प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 1: पैराबायोसिस सर्जरी के 1 दिन बाद पैराबायोंट्स के ब्लड ग्लूकोज लेवल की जांच की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 2: पैराबायोसिस सर्जरी के 1 दिन बाद पैराबायोंट्स के सीरम में माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मापा इवांस ब्लू की एकाग्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 3: ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद चूहों के सीरम में इंसुलिन की एकाग्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| 0 मिन | 5 मिन | 15 मिन | 20 मिन | 40 मिन | 60 मिन | |
| डोनर-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| प्राप्तकर्ता-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| डोनर-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| प्राप्तकर्ता-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
अनुपूरक तालिका 1: पैराबायोसिस सर्जरी के 15 दिन बाद पैराबायोंट्स में ब्लड ग्लूकोज लेवल (μmol/L) ।
| नियंत्रण-1 | डोनर-1 | प्राप्तकर्ता-1 | कंट्रोल-2 | डोनर-2 | प्राप्तकर्ता-2 | |
| ओडी मूल्य | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
अनुपूरक तालिका 2: पैराबायोसिस सर्जरी के 15 दिन बाद पैराबायोंट्स में इवांस ब्लू (ओडी वैल्यू) की रक्त एकाग्रता।
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Discussion
पैराबायोसिस में दो जीवित जानवरों को 6 ,7,8द्वारा एक सामान्य संवहनी प्रणाली स्थापित करने के लिए जोड़ने की शल्य चिकित्सा तकनीक को संदर्भित किया गयाहै. इस मॉडल का लाभ यह है कि एक ही व्यक्ति द्वारा उत्पादित पदार्थ एक ही समय में दोनों जानवरों पर कार्य कर सकते हैं। इस प्रकार, पैराबायोसिस मॉडल का उपयोग संबंधित बीमारी में किसी पदार्थ या कारक की भूमिका का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे कई सार्थक और अभिनव निष्कर्ष पैदा होते हैं। इसके महान अनुप्रयोग मूल्य को ध्यान में रखते हुए, मॉडल ने हृदय प्रणाली रोगों8,9, 10,11,12,13,तंत्रिका तंत्र विकारों14,15,अंग प्रत्यारोपण16,और मधुमेह17,18की बेहतर समझ लाया है ।
हालांकि, परिसंचरण कल्पना की सफल स्थापना का सत्यापन पैराबायोसिस के साथ अध्ययन के लिए पहला और निर्धारित कदम है। वर्तमान अध्ययनों ने परिसंचरण कल्पनावाद का पता लगाने के लिए कुछ तरीकों की सूचना दी है। Loffredo एट अल4 ने बताया कि रक्त में अलग लेबल मार्कर के साथ तिल्ली में मोनोसाइट्स की मिश्रित आवृत्ति को मापने के द्वारा पैराबायोटिक जोड़े में रक्त कल्पना की पुष्टि की गई थी (CD45.1+) और प्राप्तकर्ता (CD45.2+)चूहों । इस विधि में, पैराबायोसिस के लिए प्रत्येक पैराबायोंट के लिए सीडी45.1+- या सीडी45.2+-लेबल मोनोसाइट्स वाले विशिष्ट चूहों का उपयोग किया गया था। चिह्नित रक्त कोशिकाओं के एकीकरण को मापने के द्वारा रक्त कल्पना का निर्धारण करने के लिए सेल साइटोमेट्री की आवश्यकता थी। इसके अलावा, मार्टा एट अल3 ने इंट्रापेरिटोनी द्वारा पैराबायोंट्स में से एक में 0.5% इवांस ब्लू डाइ के 200 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा क्रॉस-सर्कुलेशन का आकलन किया। दोनों पैराबायोंट्स से रक्त 2 घंटे बाद कार्डियक पंचर द्वारा एकत्र किया गया था । रक्त कल्पना प्राप्तकर्ता चूहों में एक वृद्धि इवांस नीली एकाग्रता द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसका परीक्षण माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा किया गया था। हालांकि इन रणनीतियों हमें रक्त कल्पना निर्धारित करने की अनुमति है, वहां अभी भी कई सीमाएं है कि नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है । सबसे पहले, घातक तरीकों के लिए, रक्त कल्पना केवल निष्पादन पर पुष्टि की जा सकती है। हालांकि, हमारी विधि में, पैराबायोसिस सर्जरी के बाद रक्त कल्पना की स्थापना का परीक्षण किसी भी समय किया जा सकता है। अनावश्यक कार्यभार को कम करने के लिए असफल स्थापित परिसंचरण कल्पना वाद वाले पैराबायोंट्स को अग्रिम में आगे के अध्ययन के लिए बाहर रखा जा सकता है। दरअसल, हमारे ग्लूकोज उतार चढ़ाव विधि का उपयोग कर हम कुछ पैराबायोंट्स में रक्त कल्पना के असफल निर्माण के साथ चूहों को लेने में सक्षम थे, जो पैराबायोसिस के अपर्याप्त समय, अस्थिर सर्जरी हेरफेर, घाव भरने में देरी, या जानवर संघर्ष के कारण शरीर के ऊतकों को काट ने के कारण हो सकता है। ऐसी परिस्थितियों में इवांस ब्लू मेथड का इस्तेमाल कर खून की कल्पना की विफलता की पुष्टि भी की गई। इन परिणामों से पता चलता है कि ग्लूकोज में उतार-चढ़ाव का तरीका इवांस ब्लू मेथड(सप्लीमेंट्री फिगर 1 और सप्लीमेंट्री फिगर 2, सप्लीमेंट्री टेबल 1 और सप्लीमेंट्री टेबल 2)जितना प्रभावी था । दूसरा, सत्यापन के वर्तमान में इस्तेमाल किए गए तरीके जरूरत से ज्यादा समय लेने वाले और कठिन हैं, जैसा कि इस नई विधि के विपरीत है, जो सरल और प्रभावी है।
वर्तमान अध्ययन में, हमने ग्लूकोज उतार-चढ़ाव विधि से पैराबायोटिक चूहों में परिसंचरण कल्पना के लिए सफलतापूर्वक परीक्षण किया। चूहों को ग्लूकोज इंजेक्शन और रक्त ग्लूकोज स्तर मापन के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया गया था, जिससे उनकी हेरफेर आसान हो गई। हमने 10 एस के भीतर चूहों की पूंछ नस के माध्यम से ग्लूकोज (1.2 ग्राम/किलो) का 100 माइक्रोन इंजेक्ट किया। इन परिस्थितियों में, दाता और प्राप्तकर्ता चूहों में रक्त शर्करा के स्तर में नियमित रूप से उतार-चढ़ाव देखा गया। महत्वपूर्ण बात, ग्लूकोज की मात्रा हम एक निश्चित सीमा के भीतर रक्त ग्लूकोज के स्तर को स्थिर करने के लिए खड़ा किया । इसके अलावा, परिणामों से पता चला है कि रक्त इंसुलिन का स्तर ग्लूकोज इंजेक्शन(पूरक चित्रा 3)के बाद सामान्य रेंज 3 एच में बरामद हुआ, जिससे यह सुझाव मिलता है कि चूहों में इंजेक्ट किए गए ग्लूकोज की मात्रा का इंसुलिन मेटाबोलिज्म पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, ग्लूकोज की खुराक हम दाता को दिया है कि चूहों के ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया से कम था (GTT के लिए, 2 जी/किलो ग्लूकोज इंट्रापेरिटोनल चूहों को इंजेक्शन है, लगभग १.६ ग्राम/किलो के माध्यम से कौडल नस इंजेक्शन19,20,21),जिसका अर्थ है कि ग्लूकोज उतार चढ़ाव विधि के लिए ग्लूकोज की खुराक हाइपरग्लाघात और अन्य हानिकारक का कारण नहीं होगा निष्कर्ष में, हम जिस विधि का उपयोग करते हैं वह प्रभावी, हानिरहित और समय बचाने वाला है। हालांकि, यह पैराबायोसिस में मधुमेह चूहों तक सीमित हो सकता है, जिसे अभी भी पुष्टि के लिए आगे प्रयोगों की आवश्यकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (८१५७०३९९ और ८१७७३७३५), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम-पारंपरिक चीनी चिकित्सा आधुनिकीकरण अनुसंधान परियोजना (2017YFC1702003), और हे ई लांग जियांग द्वारा समर्थित किया गया था उत्कृष्ट युवा विज्ञान कोष (जेसी2017020) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).
