Summary
Dissocieret hippocampus cellekultur er et centralt eksperimentelt værktøj i neurovidenskab. Neurale cellers overlevelse og funktion i kultur forbedres, når korallinjeskeletter bruges som matricer på grund af deres neurobeskyttende og neuromodulerende roller. Derfor viser neurale celler dyrket på korallinjematrix højere holdbarhed og er derved mere egnede til dyrkning.
Abstract
Kulturer af dissocierede hippocampale neuronale og gliaceller er en værdifuld eksperimentel model til at studere neural vækst og funktion ved at tilvejebringe høj celleisolering og et kontrolleret miljø. Imidlertid er overlevelsen af hippocampale celler in vitro kompromitteret: de fleste celler dør i løbet af den første uge af kulturen. Det er derfor af stor betydning at identificere måder at øge holdbarheden af neurale celler i kultur.
Calciumcarbonat i form af krystallinsk aragonit afledt af korallernes skelet kan anvendes som en overlegen, aktiv matrix til neurale kulturer. Ved at pleje, beskytte og aktivere gliaceller forbedrer koralskelettet overlevelsen og væksten af disse celler in vitro bedre end andre matricer.
Denne protokol beskriver en metode til dyrkning af hippocampale celler på en korallinjematrix. Denne matrix genereres ved at fastgøre korn af koralskeletter til kulturskåle, kolber og glasdæksler. Kornene hjælper med at forbedre cellernes miljø ved at introducere dem til et fint tredimensionelt (3D) miljø at vokse på og danne vævslignende strukturer. 3D-miljøet, der introduceres af koralskelettet, kan optimeres til cellerne ved slibning, hvilket muliggør kontrol over kornets størrelse og densitet (dvs. matrixruheden), en egenskab, der har vist sig at påvirke gliacellernes aktivitet. Desuden gør brugen af korn observation og analyse af kulturerne lettere, især når man bruger lysmikroskopi. Derfor inkluderer protokollen procedurer til generering og optimering af korallinjematrixen som et værktøj til at forbedre vedligeholdelsen og funktionaliteten af neurale celler in vitro.
Introduction
Kulturer af dissocierede neurale celler, i dette tilfælde hippocampale celler, er en værdifuld eksperimentel model til undersøgelse af neural vækst og funktion ved at tilvejebringe høj celleisolering og tilgængelighed 1,2,3. Denne type kultur bruges ofte inden for neurovidenskab, lægemiddeludvikling og vævsteknik på grund af den store mængde information, der kan indsamles, såsom vækstrater og levedygtighed, neurotoksicitet, neuritudvækst og netværk, synaptisk forbindelse og plasticitet, morfologiske modifikationer, neuritters organisation og ledninger osv.1,4,5,6,7.
På trods af kulturernes betydning er de dyrkede celler normalt tvunget til at vokse på glasdæksler i et todimensionelt monolag. Disse strenge miljøændringer reducerer neurale cellers evne til at overleve over tid betydeligt, fordi glasdæksler er ikke-plejende substrater med lav vedhæftningsstyrke, der udviser en lavere kapacitet til at understøtte cellevækst 8,9,10,11.
Fordi dyrkede neurale celler er tvunget til at vokse under udfordrende forhold, ville en vigtig tilgang til at forbedre deres overlevelse være at efterligne deres naturlige miljø så meget som muligt12,13. Dette kan opnås ved at bruge biomaterialer, der fungerer som matricer og efterligner cellernes ekstracellulære matrix, så de kan danne en vævslignende struktur og hjælpe med deres næring14.
Anvendelsen af biomaterialer er en lovende tilgang til forbedring af cellekulturer, fordi de fungerer som biokompatible stilladser, der giver mekanisk stabilitet og forbedrer en række celleegenskaber, herunder vedhæftning, overlevelse, spredning, migration, morfogenese og differentiering15,16,17. Flere typer biomaterialer bruges til at forbedre cellernes betingelser in vitro. Blandt dem er biopolymerer eller biologiske komponenter, der normalt er en del af cellernes ekstracellulære matrix. Disse biomaterialer anvendes mest som en form for polymeriserede belægningsmidler eller hydrogeler18,19,20. På den ene side giver matricerne nævnt ovenfor cellerne et velkendt 3D-miljø at vokse i, tilskynder deres vedhæftning til skålen og giver dem mekanisk støtte21,22. På den anden side forstyrrer deres polymeriserede form og indeslutning af cellerne i hydrogeler cellernes adgang til plejende komponenter, der er til stede i vækstmediet, og gør også opfølgningen af cellerne ved mikroskopiske metoder vanskeligere23.
Koraleksoskeletter er biologiske matricer med havoprindelse. De er lavet af calciumcarbonat, har mekanisk stabilitet og er biologisk nedbrydelige. Tidligere undersøgelser, der bruger koralskelettet som en matrix til dyrkning af neurale celler i kultur, har vist meget større vedhæftning sammenlignet med glasdæksler24,25. Derudover viste neurale celler dyrket på koralskelet deres evne til at indtage det calcium, skelettet består af, hvilket beskytter neurale celler under betingelser med næringsstofmangel26. Desuden er koralskelettet en støttende og nærende matrix, der øger overlevelsen af neurale celler, tilskynder til dannelse af neurale netværk, hæver hastigheden af synaptisk forbindelse og muliggør dannelse af vævslignende strukturer27,28. Nylige undersøgelser har også vist, at overfladetopografien af koralskeletmatrixen spiller en afgørende rolle i fordelingen og aktiveringen af gliaceller 8,29. Koralskelet er også effektivt som en matrix til dyrkning af andre celletyper, såsom osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter i kultur (upublicerede data).
Derfor er koralskelet en lovende matrix til dyrkning af celler in vitro. Således beskriver protokollen beskrevet nedenfor teknikken til dyrkning af neurale celler på koralskelet til fremstilling af mere stabile og velstående neurale kulturer end dem, der opnås ved eksisterende metoder. Denne protokol kan også være nyttig til dyrkning af kardiomyocytter, hepatocytter og andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelsen af dyr i denne protokol blev godkendt af National Animal Care and Use Committee.
BEMÆRK: Calciumcarbonerede koralskeletter bør anvendes i krystallinsk form af aragonit. De koraltyper, der hidtil er testet for neurale kulturer , er Porites Lutea, Stylophora Pistillata og Trachyphyllia Geoffroyi. Skeletterne kan købes hele eller jordede.
1. Rengøring af koralskeletstykkerne
FORSIGTIG: Følgende trin skal udføres i en kemisk hætte ved stuetemperatur, da opløsningerne beskrevet nedenfor er farlige og kan forårsage forbrændinger og irritationer.
- Brug en hammer til at bryde koralskeletet og opdele det i 0,5-2 cm fragmenter. For at opløse organiske og ikke-organiske rester, blød koralskeletfragmenterne i 10% natriumhypochloritopløsning i 10 minutter, vask derefter en gang med dobbeltdestilleret vand (DDW).
- For at fjerne de resterende organiske rester lægges fragmenterne i blød i en 1M NaOH-opløsning i 5 minutter og vaskes derefter en gang med DDW. Fortsæt med fjernelsen af de organiske aflejringer ved at lægge fragmenterne i blød i 30%H2O2-opløsningi 10 min, vask derefter fragmenterne 3x med DDW.
- Fjern så meget overskydende DDW som muligt, og lad koralfragmenterne i emhætten tørre (1-8 timer).
2. Rengøring af glasdækslerne
- Overfør glasdækslerne til en 100 mm petriskål af glas. Tilsæt 10 ml 95% ethanol i 15 min.
- Fjern ethanolen og vask med DDW 3x, vent 10 minutter mellem hver vask. Fadet anbringes på en forvarmet varmeplade med 80 °C, indtil DDW fordamper. Rør forsigtigt dækslerne i pladen flere gange, mens du tørrer, for at forhindre, at de klæber til hinanden.
- Autoklave dækslerne.
3. Forberedelse af koralskeletkorn
- Slib koralskeletfragmenterne ved hjælp af en mørtel og stød (manuel slibning) indtil fuldstændig nedbrydning. Resultatet er en blanding af korn med størrelser fra 20 μm-200 μm.
- Alternativt kan du slibe koralskeletfragmenterne ved hjælp af en elektrisk slibemaskine med en hastighed på 1.000 o / min i 30 s (bladlængde = 6 cm; bredde = 0,5 cm-1,0 cm). Den resulterende kornstørrelse svarer til størrelsesområdet produceret ved manuel slibning.
4. Oprensning af korn i et bestemt størrelsesinterval
BEMÆRK: Hvis der ønskes kontrol over kornets størrelse i en matrix, skal du bruge følgende filtreringsbaserede kornrensningsprocedure.
- Overfør kornene til en manuel eller elektrisk 40 μm filternetsi.
- Del kornene i to specifikke intervaller ved at sigte kornene gennem silen (hvis du bruger en elektrisk si, anbefales følgende betingelser: omrystning = 600 amplituder / min, hoppende = 6 / s). Denne procedure producerer to grupper af kornstørrelser, en <40 μm og den anden >40 μm.
BEMÆRK: De to størrelser kan bestemmes ved hjælp af sier med forskellige masker. Hvis der ønskes et mere begrænset område, sigtes hver gruppe igen fra trin 4.2 gennem sier med forskellige masker. - Autoklave kornene.
5. Tilberedning af koralkornbelagte retter eller dæksedler
- Til belægning af kolber, tallerkener eller petriskåle
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres under sterile forhold.- Tilsæt koralskeletkornene i en 20 μg / ml poly-D-lysin (PDL) opløsning opløst i Hanks 'opløsning. Den anbefalede koncentration er 5 mg/10 mg korn pr. 1 ml PDL-opløsning.
- Opløsningen hældes i kolber og skåle (ca. 2 ml/25 cm2) og inkuberes natten over ved 4 °C. Kornene synker og fastgøres til bunden.
- Den næste dag vaskes kolberne og opvasken en gang med steril DDW. Lad kolberne og opvasken tørre i emhætten.
BEMÆRK: Det foretrækkes at bruge friskovertrukne kolber og fade. De coatede kolber og skåle kan anvendes op til en uge efter overtræk, hvis de opbevares ved 4 °C. Imidlertid kan matrixens effektivitet blive kompromitteret.
- Belægning af glasdæksler (12 mm diameter, 0,17 mm tykkelse)
- Tilsæt koralskeletkorn til DDW ved enhver ønsket koncentration. De almindelige tætheder, der anvendes til neurale celler, er 5 mg / ml og 10 mg / ml. Hæld 40 μL af kornopløsningen på midten af dæksedlen (figur 4).
- Anbring dækslerne på en varmeplade, der er forvarmet til 80 °C, og vent på fuldstændig fordampning (normalt 15 min). Under disse forhold klæber kornene til dæksedlen. Autoklave de coatede dæksedler. Opbevares under sterile forhold.
- En dag før dyrkning skal du placere dækslerne på låget på en steril 24 brøndplade. Der tilsættes 100 μL 20 μg/ml PDL-opløsning til hver dæksel. Brug spidsen til at sikre, at væsken dækker hele kornområdet og resten af dækseloverfladen.
- Dæk låget med bunden af pladen. Pakk siderne af pladerne med paraffinfilm. Der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Næste dag vaskes en gang med DDW og tørres i emhætten.
BEMÆRK: Det foretrækkes at bruge nycoatede coverslips.
6. Dyrkning af hippocampus dissocierede celler på koralskeletkornbelagte glasdæksler
BEMÆRK: Metoden til hippocampus dissocieret cellekultur blev ændret fra tidligere publicerede procedurer24,27. Forberedelsen af kulturen er beskrevet for fire rotteunger. Det forventede udbytte fra hver hippocampus er 1-1,5 x 106 celler.
- Installationsprogrammet
- Forbered en tom 60 mm petriskål. Hæld 2 ml minimalt essentielt medium (MEM) i en 60 mm petriskål og læg på is.
- Hæld 2 ml MEM i en 35 mm skål og kom den i en inkubator ved 37 °C, 5-10% CO2. Hæld 2 ml MEM i et 15 ml rør og opbevar det ved 4 °C.
- Hæld 1 ml First Day Medium i et 15 ml rør og kom det i en inkubator ved 37 °C, 5-10% CO2.
BEMÆRK: Sammensætningen af førstedagsmediet er beskrevet i materialetabellen. - 200 μL af en 2,5% trypsinopløsning optøs og inkuberes ved 37 °C.
- Forbered tre Pasteur-glaspipetter med hoveder med en diameter på 0,5 mm, 0,75 mm og 1,0 mm ved hjælp af en flamme.
- Forbered passende kirurgiske værktøjer: en stor saks, to små saks, en stor pincet, fire små pincet og en skalpel.
- Forbered et stereomikroskop i emhætten.
- Brug en stor saks til at ofre 0-3 dage gamle Sprague Dawley rotteunger ved at adskille deres hoveder fra deres kroppe i en tom 60 mm petriskål (trin 6.1.1). Bortskaf ligene.
- Tag hovedet op ved at holde det fra munden med en stor pincet. Skær huden, der dækker kraniet med en lille saks.
- Med en ren saks skal du indtaste under kraniet (på siden af lillehjernen) og skære kraniet til højre og til venstre for at gøre det muligt at fjerne det. Brug en lille pincet til at skrælle kraniet af hjernen.
- Med en ren pincet adskilles hjernen fra hovedet og lægges i en 60 mm petriskål indeholdende 2 ml kold MEM (se trin 6.1.2).
- Brug to små pincet til at dissekere hippocampi under et stereomikroskop. Hippocampi overføres til den tilberedte 35 mm skål (fra trin 6.1.2), der indeholder MEM.
BEMÆRK: Trin 6.3-6.6 skal gentages for hver hvalp. - Skær hippocampi i ca. 1 mm skiver ved hjælp af skalpellen. Tilsæt 200 μL trypsinopløsningen (fortyndet til en slutkoncentration på 0,25%). Bland forsigtigt og inkuber ved 37 °C, 5-10% CO2 i 30 minutter.
- Efter inkubation tilsættes 2 ml kold MEM (trin 6.1.2) til skålen for at deaktivere trypsinet. Det trypsiniserede væv overføres til et 15 ml rør indeholdende 1 ml First Day Medium, der er forvarmet til 37 °C (trin 6.1.3) ved hjælp af Pasteur-pipetten af glas med den største diameter (trin 6.1.5).
BEMÆRK: Det bedste medium til væv (v: v) forhold til videre behandling af vævet er 1 ml / 8 hippocampi. Undgå at overføre mediet med vævet så meget som muligt. - Triturer vævet ved at føre det gennem glaspipetten med den største diameter 10-15 gange. Gentag derefter denne proces ved hjælp af glaspipetten med medium diameter. Fortsæt triturering med pipetten med den mindste diameter. Undgå bobler for at reducere celledød.
- Lad de resterende vævsstykker synke i 2-5 min, og overfør derefter supernatanten til et andet 15 ml glas. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
BEMÆRK: Den foretrukne celletæthed er 200.000-400.000 celler / ml. Brug First Day Medium til at fortynde eller centrifugere ved 470 x g for at koncentrere cellerne. - Der frøes 100 μL celler på hvert glasdæksel. Under såning skal du sørge for at dække hele dæksedlen med celler. Der inkuberes ved 37 °C, 5-10 % CO2.
- Den næste dag tilsættes 500 μL neuronalt vækstmedium til brøndene.
BEMÆRK: Sammensætningen af det neuronale vækstmedium er beskrevet i materialetabellen. - Overfør forsigtigt hver dæksel til den passende brønd ved hjælp af en pincet, mens du fjerner førstedagsmediet ved at vippe dæksedlen. Sug det resterende medie fra låget.
- Der inkuberes ved 37 °C, 5-10 % CO2. Undgå at udskifte mediet under inkubation. Kulturer kan opretholdes under disse forhold op til 1 måned. Den største bekymring er fugtighed. Sørg derfor for at holde inkubatoren maksimalt befugtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at forberede koralskeletmatrixen blev hele koralskelettet (figur 1A) brudt i 0,5-2 cm fragmenter ved hjælp af en hammer (figur 1B) og grundigt rengjort fra organiske rester gennem tre trin (trin 1 i protokollen) ved anvendelse af 10% hypochloritopløsning, 1M NaOH-opløsning og 30%H2O2-opløsning(figur 1C). Koralfragmenter blev godt renset, da skeletfarven skiftede fra brun (figur 1D) til hvid (figur 1E). Derefter blev de rensede stykker (figur 2A) malet ved hjælp af enten en mørtel og støderen (figur 2B) eller en elektrisk slibemaskine (figur 2C). Begge procedurer gav lignende resultater: en blanding af korn mellem 20 μm-200 μm i størrelse (figur 2D-G).
En af fordelene ved kornet matrix over opløselige substrater er, at flere af dets strukturelle og fysiske egenskaber kan ændres, hvilket gør det mere kvantitativt. I denne koralskeletkornmatrix blev to af kornblandingsegenskaberne manipuleret: kornstørrelse og korntæthed. For at reducere størrelsesdiversiteten på 20 μm–200 μm, der genereres ved ovennævnte slibeprocedure, blev der valgt en sigtningsmetode ved hjælp af et filternet på 40 μm. Ved hjælp af manuelle (figur 3 A-D) eller elektriske (figur 3E) sier blev der fremstillet to typer kornblandinger: en med korn fra 40 μm-200 μm i størrelse (figur 3 F, H) og den anden med størrelse på 40 μm eller mindre (figur 3G, I). Tætheden af kornene, der dækkede dæksedlerne og skålene, blev bestemt simpelthen ved at anvende forskellige mængder korn og fastgøre dem til dæksedlerne ved varme (figur 4C) eller på kolber og skåle ved tyngdekraften (figur 4H). På denne måde blev matricer med lav (figur 4 D, F, I) og høje densiteter (figur 4E, G, J) produceret.
Figur 5 viser resultatet af dyrkning af hippocampale celler på dæksedler belagt med <40 μm (10 mg / ml) koralskeletkorn. Fasekontrastmikrografier viser, at cellerne dannede komplekse neurale netværk i fravær (figur 5A) og tilstedeværelse (figur 5B) af matrixen. Cellekernefarvning (figur 5C,D) indikerede, at 14 dage efter såning var celletætheden højere på matrixen end på de ubelagte dæksedler. Farvning med mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2) viste, at et komplekst neuronalt og dendritisk netværk dannet på matrixen (figur 5F) sammenlignet med kontrollen (figur 5E). Derudover gennemgik glialceller dyrket på koralskeletmatrixen visualiseret ved anvendelse af glialfibrillært surt protein (GFAP) signifikante morfologiske ændringer. De fik et spidsere udseende med længere processer end gliacellerne dyrket på kontrolsubstratet, hvor de fremstod rundere og fladere (figur 5G, H).
Figur 1: Rengøring af koralskelettet. (A) Skelettet af koralen Stylophora pistillata. (B) Nedbrudte fragmenter af skelettet inden rengøring. C) Fragmenterne fra (B) efter behandling med hypochloritopløsning, natriumhydroxid og hydrogenperoxid. D) Forstørrelse af urensede fragmenter som vist i litra B). E) Forstørrelse af rensede fragmenter som vist i punkt C. Skala: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Slibning af koralskelettet. (A) Renset koralskeletfragmenter. B) Mørtel og støder, der anvendes til manuel slibning. Rød pil peger på de resulterende korn. (C) Slibemaskine. Rød pil peger på de resulterende korn. D) Korn efter manuel formaling. E) Korn efter mekanisk formaling. f) Udvidelse af litra d). g) Udvidelse af litra e). Skala: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kontrol over kornstørrelsen. (A-D) Manuel belastningsprocedure. (A) Brug af 40 μm si. (B) Sil med uanstrengte formalede korn anbragt i et 50 ml rør og siet ved hjælp af en hvirvelstrøm. (C) Silet <40 μm korn i bunden af 50 ml røret. D) Korn med en minimal størrelse svarende til maskens størrelse (>40 μm, gul pil). (E) Mekanisk si, der anvendes til at spænde <40 μm korn fra en blanding af korn på 20 μm-200 μm. (F) Påvisning af forskellige kornstørrelser efter formaling før sigtning. (G) Påvisning af sigtede korn <40 μm. (H) Udvidelse af (F). — udvidelsen af litra g). Skala: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Styring af matrixens tæthed. (A) Et 1,5 ml centrifugeglas med <40 μm korn fortyndet til 10 mg/ml med DDW til dæksedler, PDL til andre skåle. (B) Glasdæksel med 40 μL 10 mg/ml opløsning. C) Dæksedler med 40 μL 10 mg/ml opløsning tørring på en varmeplade, der er forvarmet til 80 °C, således at kornene kan klæbe til dæksedlen. (D) Overtrukket dæksel med en kornkoncentration på 5 mg/ml efter DDW-fordampning. E) Overtrukket dæksel med en kornkoncentration på 10 mg/ml efter DDW-fordampning. f) Udvidelse af litra d). g) Udvidelse af litra e). H) En 10 mg/ml opløsning i en 60 mm T-25 kolbe. I) Overtrukket kolbe med korn i en koncentration på 5 mg/ml. J) Overtrukket kolbe med korn i en koncentration på 10 mg/ml. Skala: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dyrkning af hippocampus neurale celler på koralskeletmatrixen. Billeder viser celler ekstraheret fra 0-3 dage gamle rottehvalp hippocampi dyrket i kultur i 14 dage og farvet med GFAP (røde, gliaceller), MAP2 (grøn, neuronal somas og dendritter), DAPI (blå, cellekerner). A) Fasekontrastbillede af celler i fravær af matrixen. (B) Fasekontrastbillede af celler dyrket på koralskeletmatrixen. (C) Celler dyrket uden matrix farvet med DAPI. (D) Celler dyrket på koralskeletmatrixen farvet med DAPI. E) Celler, der er dyrket uden matrix farvet for MAP2. F) Celler dyrket på koralskeletmatrixen, der er farvet til MAP2. G) Celler dyrket uden matrix farvet til GFAP. (H) Celler dyrket på koralskeletmatrixen farvet til GFAP. (I) Flettet billede af (C),(E),(G). (J) Flettet billede af (D),(F),(H). Skala = 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken, der præsenteres her, beskriver en måde at forbedre vedligeholdelsen og funktionaliteten af neurale celler i kultur. Dette opnås ved at klæbe cellerne til en matrix lavet af koralskeletkorn, der nærer cellerne og fremmer deres vækst og aktivitet. Brug af denne teknik øger den neurale kulturmodels kapacitet til at efterligne cellernes miljø i hjernen.
Indførelsen af matrixen som et kultursubstrat har flere fordele i forhold til andre substrater, der anvendes i klassiske neurale cellekulturmetoder. For det første øger det celleadhærens. Kombinationen af koralskelet og PDL genererer en stærkere klæbeevne end glas og PDL (ikke vist). En sådan forøgelse af klæbeevnen har vist sig at være afgørende for overlevelsen af vedhængende ikke-flydende celler i kultur32. For det andet er calciumcarbonerede krystaller af koralskeletkornene en kilde til calciumioner, der faktisk absorberes af cellerne. Det er meget sandsynligt, at dette er årsagen til øget holdbarhed og øget tæthed (figur 5C, D) af neurale celler udstillet på koralskeletmatrixen sammenlignet med deres overlevelsesniveau i fravær26.
En tredje fordel ligger i, at koralskeletmatrixen faktisk er ikke-plan, i modsætning til glasdækslet. Kornene er 3D-strukturerede med en kompleks, buet overfladearkitektur. Disse strukturelle egenskaber varierer, når man overvejer, at cellerne står over for kornpopulationer med forskellige morfologier, dimensioner og tætheder. Et sådant groft og ikke-plant kulturstof efterligner bedre cellernes miljø in vivo end det klassiske flade dæksel. Faktisk har vi vist, at koralskeletets ruhed, størrelse og morfologi påvirker cellefordeling, overlevelse og aktivitet 8,26,29.
Desuden adskiller den 3D-konfiguration, som en koralskeletmatrix giver cellerne som et mikromiljø, sig væsentligt fra de konventionelle hydrogelmatricer, der anvendes til 3D-vækst in vitro. Ved anvendelse af hydrogeler, såsom kollagen og hyaluronsyre, er cellerne indlejret i gelen23. Gelen ligner den ekstracellulære matrix med hensyn til rumfyldning, stivhed og andre egenskaber, men på grund af gelernes viskositet kræver disse kulturer komplicerede fodringssystemer for at holde cellerne velnærede21,22. I modsætning hertil gør koralskelettets 3D-korn cellerne i stand til at optage deres overflade, som er helt åben for kulturmediet. I modsætning til hydrogelkulturerne overvåges cellerne på koralskeletmatrixen let gennem fase- og fluorescerende mikroskopi.
Denne teknik har flere begrænsninger. På trods af ovenstående fordele er koralskelet et biomateriale og kan ikke fremstilles, men indsamles fra døde koraller, hvilket forårsager begrænsninger i matrixforsyningen, selvom nogle er tilgængelige kommercielt. Brug af skeletter af flere koralarter kan også introducere variationer i kulturegenskaber. På den anden side eliminerer det faktum, at koralskeletkrystaller alle er lavet af et stof, aragonit, og at kornets størrelse kan kontrolleres, det meste af den kemiske og strukturelle mangfoldighed blandt matricerne. Kornene i alle testede biomaterialer er store nok til at tvinge cellerne til at vokse tredimensionelt. Cellerne klatrer på kornene8, vokser ved at fastgøre til spidserne af krystallerne33 og krydse mellem korn27. Alternativt er geologisk aragonit, fremstillet af fossile sedimenter og syntetisk calciumcarbonat, kommercielt tilgængelig og kan bruges som matrix. Det kan dog vise lavere vedhæftning til glasdækslerne.
I betragtning af brugen af flere koralarter er det vigtigt at bemærke, at nogle undersøgelser har vist tegn på biomineralisering af koraller, hvilket kan føre til tilstedeværelsen af forskellige organiske aflejringer blandt calciumcarbonatkrystallerne. Disse kan ikke fjernes ved hjælp af rengøringsprocessen beskrevet i denne protokol33,34. Denne kendsgerning er af afgørende betydning, når man identificerer et biomateriale til biologiske anvendelser. I tilfælde af denne undersøgelse blev der tidligere udført flere trin for at sikre så meget homogenitet af stilladset som muligt. Først blev tre typer koraller testet for matricer: Porites Lutea, Stylophora Pistillata og Trachyphyllia Geoffroyi. Der var ingen signifikante ændringer med hensyn til vækst og overlevelse af neurale celler på disse koralskeletter. Dette resultat kan indikere, at forskellige organiske aflejringer i skelettet ikke har nogen væsentlig indflydelse i dette tilfælde. For det andet viste Fourier-transform infrarød spektroskopi af rent koralskelet fraværet af organiske rester29.
Der er nogle kritiske skridt i protokollen, der bør tages i betragtning. For det første, mens du manuelt sigter kornene, anbefales det at udskifte silen fra tid til anden, da silerne har tendens til at tilstoppe. Den elektriske sil bruger større kraft under sigtning. Således har det ikke tendens til at tilstoppe så let. For det andet, mens du spreder PDL-koralkornblandingen på tallerkener og dæksedler, er det vigtigt at pipette blandingen ofte for at undgå synkning af kornene. Det vil sikre en homogen spredning af opløsningen. Det er vigtigt at være opmærksom på fastgørelsesprocessen af kornene til dæksedlerne. Forkerte opvarmningstemperaturer under kornfastgørelse til glasdækslet, vibrationer og andre faktorer kan få kornene til at løsne sig før eller efter cellesåning. Det anbefales at løse dette problem ved omhyggeligt at kontrollere temperaturen og minimere vibrationer. Desuden foretrækkes det at udføre forsøgene på et bestemt tidspunkt efter belægning af kolber og fade. Vi anbefaler frisk belægning af opvasken en dag før kultur. Langvarig inkubation af retter med PDL-kornblandingen kan resultere i mangfoldighed i mængden af de vedhæftede korn til skålen.
Nogle modifikationer af teknikken beskrevet ovenfor er mulige i henhold til behovene hos de dyrkede celler. Ud over dets evne til at forbedre væksten af neurale celler i kultur understøtter koralskeletmatricer vækst af osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter (upublicerede data). For at øge kulturholdbarheden af andre celletyper anbefales det at kontrollere den stærkeste cellereaktion på skeletter af forskellige koraltyper samt optimere kornets størrelse og densitet.
Det er også muligt at dyrke neurale celler direkte på kornene uden yderligere belægning. Imidlertid forbedrer forbelægningen af kornene med PDL, som nævnt i denne protokol (trin 5), i høj grad vedhæftningen og overlevelsen af neurale celler over niveauerne opnået med PDL-belagt glas. Det er også muligt at anvende andre belægningsmaterialer i henhold til præferencen for forskellige celletyper.
Det er værd at nævne, at størrelsen af kornene i matrixen er begrænset. Over en vis tærskel, ca. 200 μm, bliver det vanskeligt at binde dem til glasdækslerne. Derfor har matrixoverfladens ruhed et begrænset interval. Eksperimenter, der kræver større korn eller stykker skelet, er ikke egnede til denne teknik. Man kan finde en alternativ måde at fastgøre større korn på, måske ved hjælp af lim eller geler, men dette kan skjule cellekontakten med kornene. En anden mulighed er at dyrke cellerne direkte på skelettet uden slibning. Denne metode kræver en ændring af cellesåningsproceduren24,27. 3D-strukturen af det ikke-jordede koralskelet bidrager til neurale cellers overlevelse, som vi rapporterede før26. En sådan kompleks og tæt matrix gør imidlertid mikroskopiarbejde vanskeligt. Den kompromitterede opsætning af jordskelettet bevarer skeletets kemiske egenskaber, muliggør 2D-mikroskopianalyse, og på grund af kornets store størrelse tvinger cellerne til at vokse i 3D8.
Endvidere kan et overskud af koralskeletkorn være giftigt. Som nævnt ovenfor absorberes calciumkomponenten i koralskeletmatrixen af cellerne35. Calciumoverskud forårsaget af høj korntæthed kan være en byrde eller endda hæmmende for nogle celletyper, som i tilfælde af neurale celler36. Derfor kan en reduktion af korndensitet være påkrævet og optimeret til hver celletype. Derudover er det vigtigt at huske, at tilgængeligheden af koralskelet kan være begrænset. Koraller vokser langsomt i akvarier og i deres naturlige miljø. Deres vækst hæmmes yderligere som følge af den globale opvarmning og forsuringen af havene37. Således er overflod og tilgængelighed af koralskeletter begrænset.
Styrkelsen af de dissocierede neurale celler, når de er i kontakt med koralskeletkorn i kultur, åbner nye veje for forskning i neurobiologi. Cellulær vækst, neuritisk forlængelse og forgrening samt synaptogenese og synaptisk plasticitet kan studeres med forbedret intensitet og langvarig eksperimentel varighed.
Det ser også ud til, at korallinjematrixen forårsager en stigning i nogle af gliacellernes cellulære funktioner, såsom vækst, reaktivitet og spredning. Det er derfor muligt, at disse tilstande også øger astrocytisk kapacitet til at berige de dissocierede neurale kulturmedier med udskillede trofiske faktorer, noget der kan være anvendeligt til regenerativ medicin i centralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af KAMIN programmet fra det israelske handels- og arbejdsministerium og af Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R.
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
