Summary
La culture cellulaire dissociée de l’hippocampe est un outil expérimental essentiel en neurosciences. La survie et la fonction des cellules neurales en culture sont améliorées lorsque les squelettes coralliniques sont utilisés comme matrices, en raison de leurs rôles neuroprotecteurs et neuromodulateurs. Par conséquent, les cellules neurales cultivées sur la matrice coralline montrent une durabilité plus élevée et sont donc plus adéquates pour la culture.
Abstract
Les cultures de cellules neuronales et gliales hippocampiques dissociées constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation cellulaire élevée et un environnement contrôlé. Cependant, la survie des cellules de l’hippocampe in vitro est compromise : la plupart des cellules meurent au cours de la première semaine de culture. Il est donc très important d’identifier des moyens d’augmenter la durabilité des cellules neurales en culture.
Le carbonate de calcium sous forme d’aragonite cristalline dérivée du squelette des coraux peut être utilisé comme matrice supérieure et active pour les cultures neuronales. En nourrissant, protégeant et activant les cellules gliales, le squelette corallien améliore la survie et la croissance de ces cellules in vitro mieux que les autres matrices.
Ce protocole décrit une méthode de culture de cellules hippocampiques sur une matrice corallienne. Cette matrice est générée en attachant des grains de squelettes de corail à des plats de culture, des flacons et des lamelles de verre en verre. Les grains aident à améliorer l’environnement des cellules en les introduisant dans un environnement tridimensionnel fin (3D) pour se développer et former des structures ressemblant à des tissus. L’environnement 3D introduit par le squelette corallien peut être optimisé pour les cellules par broyage, ce qui permet de contrôler la taille et la densité des grains (c’est-à-dire la rugosité de la matrice), une propriété qui s’est avérée influencer l’activité des cellules gliales. De plus, l’utilisation de grains facilite l’observation et l’analyse des cultures, en particulier lors de l’utilisation de la microscopie optique. Par conséquent, le protocole comprend des procédures pour la génération et l’optimisation de la matrice coralline en tant qu’outil pour améliorer la maintenance et la fonctionnalité des cellules neurales in vitro.
Introduction
Les cultures de cellules neurales dissociées, en l’occurrence les cellules hippocampiques, constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation et une accessibilité cellulaires élevées 1,2,3. Ce type de culture est fréquemment utilisé en neurosciences, en développement de médicaments et en ingénierie tissulaire en raison de la grande quantité d’informations qui peuvent être collectées, telles que les taux de croissance et de viabilité, la neurotoxicité, la croissance et la mise en réseau des neurites, la connectivité synaptique et la plasticité, les modifications morphologiques, l’organisation et le câblage des neurites, etc.1,4,5,6,7.
Malgré l’importance des cultures, les cellules cultivées sont généralement forcées de se développer sur des lamelles de verre dans une monocouche bidimensionnelle. Ces modifications environnementales strictes diminuent considérablement la capacité des cellules neurales à survivre au fil du temps, car les lamelles de verre sont des substrats non nourrissants avec une faible force d’adhérence, présentant une capacité inférieure à soutenir la croissance cellulaire 8,9,10,11.
Parce que les cellules neurales cultivées sont forcées de croître dans des conditions difficiles, une approche essentielle pour améliorer leur survie serait d’imiter leur environnement naturel autant que possible12,13. Cela pourrait être réalisé en utilisant des biomatériaux qui agiront comme des matrices et imiteront la matrice extracellulaire des cellules, leur permettant de former une structure tissulaire et d’aider à leur alimentation14.
L’utilisation de biomatériaux est une approche prometteuse pour améliorer les cultures cellulaires, car ils agissent comme des échafaudages biocompatibles, assurant la stabilité mécanique et améliorant une variété de propriétés cellulaires, y compris l’adhésion, la survie, la prolifération, la migration, la morphogenèse et la différenciation15,16,17. Plusieurs types de biomatériaux sont utilisés pour améliorer les conditions des cellules in vitro. Parmi eux se trouvent des biopolymères, ou composants biologiques qui font généralement partie de la matrice extracellulaire des cellules. Ces biomatériaux sont principalement utilisés comme forme d’agents d’enrobage polymérisés ou d’hydrogels18,19,20. D’une part, les matrices mentionnées ci-dessus donnent aux cellules un environnement 3D familier pour se développer, favorisent leur adhésion à la capsule et leur donnent un soutien mécanique21,22. D’autre part, leur forme polymérisée et le confinement des cellules dans les hydrogels perturbent l’accès des cellules aux composants nourriciers présents dans le milieu de croissance et rendent également plus difficile le suivi des cellules par des méthodes microscopiques23.
Les exosquelettes coralliens sont des matrices biologiques d’origine marine. Ils sont faits de carbonate de calcium, ont une stabilité mécanique et sont biodégradables. Des études antérieures utilisant le squelette de corail comme matrice pour la croissance de cellules neurales en culture ont montré une adhésion beaucoup plus grande, par rapport aux lamelles de couvertureen verre 24,25. De plus, les cellules neurales cultivées sur le squelette de corail ont démontré leur capacité à absorber le calcium dont le squelette est composé, ce qui protège les cellules neurales dans des conditions de privation de nutriments26. De plus, le squelette corallien est une matrice de soutien et de soutien qui augmente la survie des cellules neurales, encourage la formation de réseaux neuronaux, élève le taux de connectivité synaptique et permet la formation de structures tissulaires27,28. Des études récentes ont également montré que la topographie de surface de la matrice du squelette corallien joue un rôle crucial dans la distribution et l’activation des cellules gliales 8,29. En outre, le squelette de corail est efficace comme matrice pour la culture d’autres types de cellules, tels que les ostéocytes30,31, les hépatocytes et les cardiomyocytes en culture (données non publiées).
Par conséquent, le squelette de corail est une matrice prometteuse pour la culture de cellules in vitro. Ainsi, le protocole détaillé ci-dessous décrit la technique de culture de cellules neurales sur squelette de corail pour produire des cultures neuronales plus stables et prospères que celles obtenues par les méthodes existantes. Ce protocole peut également être utile pour la culture de cardiomyocytes, d’hépatocytes et d’autres types de cellules.
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Protocol
L’utilisation d’animaux dans ce protocole a été approuvée par le Comité national de soin et d’utilisation des animaux.
NOTE: Les squelettes de coraux carbonatés de calcium doivent être utilisés sous forme cristalline d’aragonite. Les types de coraux testés jusqu’à présent pour les cultures neuronales sont Porites Lutea, Stylophora Pistillata et Trachyphyllia Geoffroyi. Les squelettes peuvent être achetés entiers ou moulus.
1. Nettoyage des morceaux de squelette de corail
ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte chimique à température ambiante, car les solutions décrites ci-dessous sont dangereuses et peuvent causer des brûlures et des irritations.
- Utilisez un marteau pour briser le squelette de corail et divisez-le en fragments de 0,5 à 2 cm. Afin de dissoudre les résidus organiques et non organiques, faire tremper les fragments du squelette de corail dans une solution d’hypochlorite de sodium à 10% pendant 10 min, puis laver une fois avec de l’eau bidistillée (DDW).
- Pour éliminer les résidus organiques restants, faire tremper les fragments dans une solution de NaOH 1M pendant 5 min, puis laver une fois avec DDW. Poursuivre l’élimination des dépôts organiques en faisant tremper les fragments dans une solution à 30% H2O2 pendant 10 min, puis laver les fragments 3x avec DDW.
- Enlevez autant d’excès de DDW que possible et laissez sécher les fragments de corail dans la capuche (1–8 h).
2. Nettoyage des lamelles de verre
- Transférer les lamelles de verre dans une boîte de Petri en verre de 100 mm. Ajouter 10 mL d’éthanol à 95 % pendant 15 min.
- Retirer l’éthanol et laver avec DDW 3x, en attendant 10 min entre chaque lavage. Placer la capsule sur une plaque chauffante préchauffée à 80 °C jusqu’à ce que le DDW s’évapore. Remuez doucement les lamelles de couverture dans la plaque plusieurs fois pendant le séchage pour les empêcher de coller les unes aux autres.
- Autoclave les lamelles de couverture.
3. Préparation des grains de squelette de corail
- Broyer les fragments du squelette de corail à l’aide d’un mortier et d’un pilon (broyage manuel) jusqu’à décomposition complète. Le résultat est un mélange de grains avec des tailles allant de 20 μm à 200 μm.
- Vous pouvez également broyer les fragments du squelette de corail à l’aide d’une rectifieuse électrique à une vitesse de 1 000 tr/min pendant 30 s (longueur de la lame = 6 cm; largeur = 0,5 cm–1,0 cm). La taille des grains résultante est similaire à la plage de taille produite par le meulage manuel.
4. Purification de grains d’une gamme de tailles spécifique
REMARQUE : Si l’on souhaite contrôler la taille des grains dans une matrice, utiliser la procédure de purification des grains basée sur la filtration suivante.
- Transférer les grains sur une crépine filtrante manuelle ou électrique de 40 μm.
- Diviser les grains en deux gammes spécifiques en tamisant les grains à travers la passoire (si vous utilisez une passoire électrique, les conditions suivantes sont recommandées: agitation = 600 amplitudes/min, rebond = 6/s). Cette procédure produit deux groupes de granulomets, l’un <40 μm et le second >40 μm.
REMARQUE: Les deux tailles peuvent être déterminées à l’aide de crépines à mailles variables. Si une plage plus restreinte est souhaitée, tamisez à nouveau chaque groupe à partir de l’étape 4.2 à travers des crépines à mailles différentes. - Autoclaver les grains.
5. Préparation de plats enrobés de grains de corail ou de bordereaux de couverture
- Pour enrober des flacons, des plaques ou des boîtes de Petri
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.- Ajouter les grains du squelette de corail dans une solution de poly-D-lysine (PDL) de 20 μg/mL dissoute dans la solution de Hanks. La concentration recommandée est de 5 mg/10 mg de grains par 1 mL de solution PDL.
- Verser la solution dans des flacons et des plats (environ 2 mL/25 cm2) et incuber toute la nuit à 4 °C. Les grains coulent et se fixent au fond.
- Le lendemain, lavez les flacons et la vaisselle une fois avec du DDW stérile. Laissez sécher les flacons et la vaisselle dans la hotte.
NOTE: Il est préférable d’utiliser des flacons et des plats fraîchement enrobés. Les flacons et plats enduits peuvent être utilisés jusqu’à une semaine après le revêtement s’ils sont conservés à 4 °C. Cependant, l’efficacité de la matrice peut être compromise.
- Revêtement des lamelles de verre (12 mm de diamètre, 0,17 mm d’épaisseur)
- Ajouter des grains de squelette de corail à DDW à la concentration désirée. Les densités courantes utilisées pour les cellules neurales sont de 5 mg/mL et 10 mg/mL. Verser 40 μL de la solution granulée au centre de la lamelle de couverture (Figure 4).
- Placez les lamelles de couverture sur une plaque chauffante préchauffée à 80 °C et attendez l’évaporation complète (généralement 15 min). Dans ces conditions, les grains adhèrent à la lamelle de couverture. Autoclaver les lamelles de recouvrement enduites. Conserver dans des conditions stériles.
- Un jour avant la culture, placez les lamelles de couverture sur le couvercle d’une plaque stérile de 24 puits. Ajouter 100 μL de solution PDL à 20 μg/mL à chaque lame-couvercle. Utilisez l’embout pour vous assurer que le liquide recouvre toute la région du grain et le reste de la surface de la lamelle de couverture.
- Couvrez le couvercle avec le fond de la plaque. Enveloppez les côtés des assiettes avec un film de paraffine. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
- Le lendemain, laver une fois avec DDW et sécher dans la hotte.
NOTE: Il est préférable d’utiliser des lamelles de couverture fraîchement enduites.
6. Culture de cellules dissociées de l’hippocampe sur des lamelles de verre recouvertes de grains de squelette de corail
NOTE: La méthode de culture cellulaire dissociée de l’hippocampe a été modifiée par rapport aux procédures publiées précédemment24,27. La préparation de la culture est décrite pour quatre ratons. Le rendement attendu de chaque hippocampe est de 1 à 1,5 x 106 cellules.
- Coup monté
- Préparez une boîte de Petri vide de 60 mm. Verser 2 mL de milieu essentiel minimal (MEM) dans une boîte de Petri de 60 mm et mettre sur de la glace.
- Verser 2 mL de MEM dans une capsule de 35 mm et le mettre dans un incubateur à 37 °C, 5–10% CO2. Verser 2 mL de MEM dans un tube de 15 mL et le maintenir à 4 °C.
- Verser 1 mL de First Day Medium dans un tube de 15 mL et le mettre dans un incubateur à 37 °C, 5-10% CO2.
REMARQUE : La composition du milieu du premier jour est décrite dans le tableau des matières. - Décongeler 200 μL d’une solution de trypsine à 2,5 % et incuber à 37 °C.
- Préparez trois pipettes Pasteur en verre avec des têtes de 0,5 mm, 0,75 mm et 1,0 mm de diamètre à l’aide d’une flamme.
- Préparez des outils chirurgicaux adéquats: un gros ciseau, deux petits ciseaux, une grande pince à épiler, quatre petites pinces à épiler et un scalpel.
- Préparez un stéréomicroscope dans la hotte.
- À l’aide d’un gros ciseau, sacrifiez les ratons Sprague Dawley âgés de 0 à 3 jours en séparant leur tête de leur corps dans une boîte de Petri vide de 60 mm (étape 6.1.1). Éliminez les corps.
- Ramassez la tête en la tenant de la bouche avec une grosse pince à épiler. Coupez la peau recouvrant le crâne avec un petit ciseau.
- Avec un ciseau propre, entrez sous le crâne (sur le côté du cervelet) et coupez le crâne à droite et à gauche pour permettre son retrait. À l’aide d’une petite pince à épiler, retirez le crâne du cerveau.
- À l’aide d’une pince à épiler propre, séparer la cervelle de la tête et la placer dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 2 ml de MEM froid (voir étape 6.1.2).
- À l’aide de deux petites pincettes, disséquez l’hippocampe sous un stéréomicroscope. Transférer l’hippocampe dans la capsule préparée de 35 mm (à partir de l’étape 6.1.2) contenant du MEM.
REMARQUE : Les étapes 6.3 à 6.6 doivent être répétées pour chaque chiot. - Couper l’hippocampe en tranches d’environ 1 mm à l’aide du scalpel. Ajouter 200 μL de la solution de trypsine (diluée à une concentration finale de 0,25%). Mélanger délicatement et incuber à 37 °C, 5–10% CO2 pendant 30 min.
- Après l’incubation, ajouter 2 mL de MEM froid (étape 6.1.2) dans la capsule pour désactiver la trypsine. Transférer le tissu trypsinisé dans un tube de 15 mL contenant 1 mL de milieu Premier Jour préchauffé à 37 °C (étape 6.1.3) à l’aide de la pipette Pasteur en verre du plus grand diamètre (étape 6.1.5).
REMARQUE: Le meilleur rapport milieu / tissu (v: v) pour le traitement ultérieur du tissu est de 1 mL / 8 hippocampe. Évitez autant que possible de transférer le milieu avec le tissu. - Triturez le tissu en le faisant passer 10 à 15 fois dans la pipette en verre de plus grand diamètre. Ensuite, répétez ce processus à l’aide de la pipette en verre de diamètre moyen. Continuez à triturer avec la pipette de plus petit diamètre. Évitez les bulles pour réduire la mort cellulaire.
- Laisser couler les morceaux de tissu restants pendant 2 à 5 minutes, puis transférer le surnageant dans un autre tube de 15 mL. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
REMARQUE: La densité cellulaire préférable est de 200 000 à 400 000 cellules / mL. Utiliser le milieu Premier Jour pour diluer ou centrifuger à 470 x g pour concentrer les cellules. - Ensemencer 100 μL de cellules sur chaque lamelle de verre. Pendant l’ensemencement, assurez-vous de couvrir toute la lamelle de couverture avec des cellules. Incuber à 37 °C, 5–10% CO2.
- Le lendemain, ajoutez 500 μL de milieu de croissance neuronale aux puits.
NOTE: La composition du milieu de croissance neuronale est décrite dans le tableau des matériaux. - Transférer délicatement chaque lamelle de couverture dans son puits approprié à l’aide d’une pince à épiler tout en retirant le support Premier jour en inclinant le capiton. Aspirez le reste du média du couvercle.
- Incuber à 37 °C, 5–10% CO2. Évitez de remplacer le milieu tout au long de l’incubation. Les cultures peuvent être maintenues dans ces conditions jusqu’à 1 mois. La principale préoccupation est l’humidité. Par conséquent, assurez-vous de maintenir l’incubateur humidifié au maximum.
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Representative Results
Afin de préparer la matrice du squelette corallien, l’ensemble du squelette corallien (Figure 1A) a été brisé en fragments de 0,5 à 2 cm à l’aide d’un marteau (Figure 1B) et soigneusement nettoyé des résidus organiques en trois étapes (étape 1 du protocole) en utilisant une solution d’hypochlorite à 10%, une solutionde NaOH 1M et une solution H 2 O2 à 30% (Figure 1C). Les fragments de corail ont été bien nettoyés lorsque la couleur du squelette est passée du brun (Figure 1D) au blanc (Figure 1E). Ensuite, les pièces nettoyées (figure 2A) ont été broyées à l’aide d’un mortier et d’un pilon (figure 2B) ou d’une rectifieuse électrique (figure 2C). Les deux procédures ont donné des résultats similaires : un mélange de grains d’une taille comprise entre 20 μm et 200 μm (figure 2D-G).
L’un des avantages de la matrice grainée par rapport aux substrats solubles est que plusieurs de ses propriétés structurelles et physiques peuvent être modifiées, ce qui la rend plus quantitative. Dans cette matrice de grains du squelette de corail, deux des propriétés du mélange de grains ont été manipulées: la taille et la densité des grains. Pour réduire la diversité granulométrique de 20 μm à 200 μm générée par la procédure de broyage ci-dessus, une approche de tamisage utilisant un treillis filtrant de 40 μm a été choisie. À l’aide de passoires manuelles (figure 3 A–D) ou électriques (figure 3E), deux types de mélanges de grains ont été produits : l’un avec des grains d’une taille variant de 40 μm à 200 μm (figure 3 F,H) et le second avec des grains de 40 μm ou moins (figure 3G,I). La densité des grains qui recouvraient les lamelles de couverture et les plats a été déterminée simplement en appliquant des quantités variables de grains et en les fixant aux lamelles de couverture par la chaleur (figure 4C) ou aux flacons et plats par gravité (figure 4H). De cette façon, des matrices de faibles (Figure 4 D, F, I) et de fortes densités (Figure 4E, G, J) ont été produites.
La figure 5 montre le résultat de la culture de cellules hippocampiques sur des lamelles de couverture recouvertes de grains de squelette de corail de <40 μm (10 mg/mL). Les micrographies à contraste de phase montrent que les cellules ont formé des réseaux neuronaux complexes en l’absence (Figure 5A) et en présence (Figure 5B) de la matrice. La coloration des noyaux cellulaires (figure 5C,D) indiquait que 14 jours après l’ensemencement, la densité cellulaire était plus élevée sur la matrice que sur les lamelles de couverture non revêtues. La coloration avec la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2) a montré qu’un réseau neuronal et dendritique complexe s’est formé sur la matrice (Figure 5F) par rapport au témoin (Figure 5E). De plus, les cellules gliales cultivées sur la matrice du squelette corallien visualisées à l’aide de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ont subi des changements morphologiques importants. Elles ont acquis un aspect plus hérissé avec des processus plus longs que les cellules gliales cultivées sur le substrat témoin, où elles sont apparues plus rondes et plus plates (Figure 5G,H).
Figure 1 : Nettoyage du squelette de corail. (A) Le squelette du corail Stylophora pistillata. (B) Fragments décomposés du squelette avant le nettoyage. (C) Les fragments de (B) après traitement avec une solution d’hypochlorite, d’hydroxyde de sodium et de peroxyde d’hydrogène. (D) Agrandissement du fragment non nettoyé représenté au point B). E) Agrandissement du fragment nettoyé illustré au point C). Échelle: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Broyage du squelette de corail. (A) Fragments de squelette de corail nettoyés. (B) Mortier et pilon utilisés pour le broyage manuel. La flèche rouge pointe vers les grains résultants. C) Machine à rectifier. La flèche rouge pointe vers les grains résultants. D) Grains après mouture manuelle. E) Grains après broyage mécanique. f) Élargissement de l’alinéa d). g) Élargissement de l’alinéa E). Échelle: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Contrôle de la granulométrie des grains. (A-D) Procédure de contrainte manuelle. (A) Utilisation d’une crépine de 40 μm. (B) Crépine avec grains moulus non filtrés placés dans un tube de 50 ml et filtrés à l’aide d’un vortex. (C) Grains filtrés de <40 μm au fond du tube de 50 mL. D) Grains d’un calibre minimal similaire à celui de la maille (>40 μm, flèche jaune). (E) Crépine mécanique utilisée pour filtrer des grains de <40 μm à partir d’un mélange de grains de 20 μm à 200 μm. (F) Démonstration de différentes tailles de grains après broyage avant égouttage. g) Démonstration de grains filtrés <40 μm. (H) Élargissement de (F). i) Élargissement du point g). Échelle: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Contrôle de la densité de la matrice. (A) Un tube à centrifuger de 1,5 mL avec des grains de <40 μm dilués à 10 mg/mL avec DDW pour les lamelles de couverture, PDL pour les autres plats. (B) Feuillet de verre contenant 40 μL de solution à 10 mg/mL. (C) Bordereaux de couverture avec 40 μL de solution de séchage à 10 mg/mL sur une plaque chauffante préchauffée à 80 °C, permettant aux grains d’adhérer à la lamelle de couverture. (D) Feuillet de couverture revêtu d’une concentration de grain de 5 mg/mL après évaporation du DDW. (E) Feuillet de recouvrement revêtu d’une concentration de grain de 10 mg/mL après évaporation du DDW. f) Élargissement de l’alinéa d). g) Élargissement de l’alinéa E). H) Une solution à 10 mg/mL dans une fiole T-25, plaque de 60 mm. (I) Fiole enrobée de grains à une concentration de 5 mg/mL. J) Fiole enduite de grains à une concentration de 10 mg/mL. Échelle: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Culture de cellules neurales hippocampiques sur la matrice du squelette du corail. Les images montrent des cellules extraites d’hippocampes de ratons âgés de 0 à 3 jours cultivés en culture pendant 14 jours et colorés avec GFAP (cellules gliales rouges), MAP2 (verts, somas neuronaux et dendrites), DAPI (noyaux cellulaires bleus). (A) Image de contraste de phase des cellules en l’absence de la matrice. (B) Image de contraste de phase de cellules cultivées sur la matrice du squelette du corail. (C) Cellules cultivées sans matrice colorées avec DAPI. (D) Cellules cultivées sur la matrice du squelette du corail colorées au DAPI. (E) Cellules cultivées en l’absence de la matrice colorée pour MAP2. (F) Cellules cultivées sur la matrice du squelette du corail colorées pour MAP2. (G) Cellules cultivées sans matrice colorée pour le GFAP. (H) Cellules cultivées sur la matrice du squelette de corail colorées pour le GFAP. (I) Image fusionnée de (C),(E),(G). (J) Image fusionnée de (D),(F),(H). Échelle = 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La technique présentée ici décrit un moyen d’améliorer le maintien et la fonctionnalité des cellules neurales en culture. Ceci est réalisé en adhérant les cellules à une matrice faite de grains de squelette de corail qui nourrit les cellules et favorise leur croissance et leur activité. L’utilisation de cette technique augmente la capacité du modèle de culture neuronale à imiter l’environnement des cellules dans le cerveau.
L’introduction de la matrice en tant que substrat de culture présente plusieurs avantages par rapport aux autres substrats utilisés dans les méthodes classiques de culture de cellules neurales. Tout d’abord, il augmente l’adhésion cellulaire. La combinaison du squelette de corail et de la PDL génère une adhérence plus forte que le verre et la PDL (non représentée). Une telle augmentation de l’adhérence s’est avérée essentielle à la survie des cellules adhérentes non flottantes en culture32. Deuxièmement, les cristaux carbonatés de calcium des grains du squelette de corail sont une source d’ions calcium qui sont réellement absorbés par les cellules. Il est fort probable que ce soit la raison de la durabilité accrue et de l’augmentation de la densité (Figure 5C,D) des cellules neurales exposées sur la matrice du squelette corallien, par rapport à leur niveau de survie en son absence26.
Un troisième avantage réside dans le fait que la matrice du squelette de corail est en fait non plane, contrairement à la couche de couverture en verre. Les grains sont structurés en 3D avec une architecture de surface complexe et incurvée. Ces propriétés structurelles varient si l’on considère que les cellules font face à des populations de grains de morphologies, de dimensions et de densités variables. Une substance de culture aussi rugueuse et non plane imite mieux le milieu des cellules in vivo que la couche de couverture plate classique. En effet, nous avons montré que la rugosité, la taille et la morphologie du squelette corallien affectent la distribution, la survie et l’activitécellulaires 8,26,29.
De plus, la configuration 3D qu’une matrice de squelette de corail fournit aux cellules en tant que microenvironnement diffère considérablement des matrices d’hydrogel conventionnelles utilisées pour la croissance 3D in vitro. Lors de l’utilisation d’hydrogels, tels que le collagène et l’acide hyaluronique, les cellules sont intégrées dans le gel23. Le gel ressemble à la matrice extracellulaire en termes de remplissage de l’espace, de rigidité et d’autres attributs, mais en raison de la viscosité des gels, ces cultures exigent des systèmes d’alimentation compliqués afin de garder les cellules bien nourries21,22. En revanche, les grains 3D du squelette de corail permettent aux cellules d’occuper leur surface, qui est complètement ouverte au milieu de culture. De plus, contrairement aux cultures d’hydrogel, les cellules de la matrice du squelette du corail sont facilement surveillées par microscopie de phase et fluorescente.
Cette technique a plusieurs limites. Malgré les avantages énumérés ci-dessus, le squelette de corail est un biomatériau et ne peut pas être fabriqué mais collecté à partir de coraux morts, ce qui limite l’approvisionnement en matrices, bien que certains soient disponibles dans le commerce. En outre, l’utilisation de squelettes de plusieurs espèces de coraux peut introduire des variations dans les propriétés de culture. D’autre part, le fait que les cristaux de squelette de corail soient tous constitués d’une seule substance, l’aragonite, et que la taille des grains puisse être contrôlée, élimine la majeure partie de la diversité chimique et structurelle entre les matrices. Les grains de tous les biomatériaux testés sont suffisamment grands pour forcer les cellules à se développer en trois dimensions. Les cellules grimpent sur les grains8, grandissent en se fixant aux extrémités des cristaux33 et se croisent entre les grains27. Alternativement, l’aragonite géologique, faite de sédiments fossiles et de carbonate de calcium synthétique, est disponible dans le commerce et peut être utilisée comme matrice. Cependant, il peut montrer une adhérence plus faible aux lamelles de couvercle en verre.
Compte tenu de l’utilisation de plusieurs espèces de coraux, il est important de noter que certaines études ont montré des preuves de biominéralisation des coraux, ce qui peut conduire à la présence de divers dépôts organiques parmi les cristaux de carbonate de calcium. Ceux-ci ne peuvent pas être enlevés en utilisant le processus de nettoyage décrit dans ce protocole33,34. Ce fait est d’une importance cruciale lors de l’identification d’un biomatériau pour des applications biologiques. Dans le cas de cette étude, plusieurs étapes ont été préalablement réalisées afin d’assurer le plus d’homogénéité possible de l’échafaudage. Tout d’abord, trois types de coraux ont été testés pour les matrices: Porites Lutea, Stylophora Pistillata et Trachyphyllia Geoffroyi. Il n’y a pas eu de changements significatifs en termes de croissance et de survie des cellules neurales sur ces squelettes coralliens. Ce résultat peut indiquer que les différents dépôts organiques dans le squelette ne sont pas d’une influence significative dans ce cas. Deuxièmement, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier du squelette de corail propre a montré l’absence de résidus organiques29.
Certaines étapes critiques du protocole devraient être prises en considération. Tout d’abord, lors du tamisage manuel des grains, il est recommandé de remplacer la passoire de temps en temps, car les crépines ont tendance à se boucher. La crépine électrique utilise une plus grande force lors du tamisage. Ainsi, il n’a pas tendance à se boucher aussi facilement. Deuxièmement, lors de la dispersion du mélange PDL-grains de corail sur les plats et les lames de couverture, il est important de pipeter fréquemment le mélange pour éviter l’enfoncement des grains. Cela assurera une dispersion homogène de la solution. Il est important de faire attention au processus de fixation des grains aux lamelles de couverture. Des températures de chauffage incorrectes lors de la fixation du grain à la glissière de verre, des vibrations et d’autres facteurs peuvent entraîner le détachement des grains avant ou après l’ensemencement cellulaire. Il est recommandé de résoudre ce problème en contrôlant soigneusement la température et en minimisant les vibrations. De plus, il est préférable d’effectuer les expériences à un moment précis après avoir enduit les flacons et la vaisselle. Nous recommandons d’enrober les plats fraîchement un jour avant la culture. L’incubation prolongée des plats avec le mélange de grains PDL peut entraîner une diversité dans la quantité de grains attachés au plat.
Certaines modifications de la technique décrite ci-dessus sont possibles en fonction des besoins des cellules cultivées. En plus de sa capacité à améliorer la croissance des cellules neurales en culture, les matrices squelettes coralliennes soutiennent la croissance des ostéocytes30,31, des hépatocytes et des cardiomyocytes (données non publiées). Pour augmenter la durabilité de la culture d’autres types de cellules, il est recommandé de vérifier la réaction cellulaire la plus forte aux squelettes de différents types de coraux, ainsi que d’optimiser la taille et la densité des grains.
Il est également possible de cultiver des cellules neurales directement sur les grains, sans revêtement supplémentaire. Cependant, le pré-enrobage des grains avec PDL, comme mentionné dans ce protocole (étape 5) améliore fortement l’adhésion et la survie des cellules neurales, au-dessus des niveaux obtenus avec du verre enduit de PDL. Il est également possible d’utiliser d’autres matériaux de revêtement en fonction de la préférence des différents types de cellules.
Il convient de mentionner que la taille des grains dans la matrice est limitée. Au-delà d’un certain seuil, environ 200 μm, il devient difficile de les lier aux lamelles de couvercle. Par conséquent, la rugosité de la surface de la matrice a une plage finie. Les expériences nécessitant des grains plus gros ou des morceaux de squelette ne conviennent pas à cette technique. On peut trouver un autre moyen d’attacher des grains plus gros, peut-être en utilisant des colles ou des gels, mais cela peut obscurcir le contact cellulaire avec les grains. Une autre possibilité est de cultiver les cellules directement sur le squelette, sans broyer. Cette méthode nécessite une modification de la procédure d’ensemencement cellulaire24,27. La structure 3D du squelette de corail non terrestre contribue à la survie des cellules neurales, comme nous l’avons signalé avant26. Cependant, une matrice aussi complexe et dense rend le travail de microscopie difficile. La configuration compromise du squelette au sol préserve les propriétés chimiques du squelette, permet l’analyse par microscopie 2D et, en raison de la grande taille des grains, force les cellules à se développer en 3D8.
En outre, un excès de grains de squelette de corail peut être toxique. Comme mentionné ci-dessus, le composant calcium de la matrice du squelette corallien est absorbé par les cellules35. L’excès de calcium causé par une densité de grains élevée peut être un fardeau ou même inhibiteur pour certains types de cellules, comme dans le cas des cellules neurales36. Par conséquent, une réduction de la densité de grain peut être nécessaire et optimisée pour chaque type de cellule. De plus, il est important de se rappeler que la disponibilité du squelette corallien peut être limitée. Les coraux poussent lentement dans les aquariums et dans leur environnement naturel. Leur croissance est encore freinée par le réchauffement climatique et l’acidification des océans37. Ainsi, l’abondance et la disponibilité des squelettes coralliens sont limitées.
Le renforcement des cellules neurales dissociées au contact des grains du squelette de corail en culture ouvre de nouvelles pistes de recherche en neurobiologie. La croissance cellulaire, l’extension et la ramification neuritiques, ainsi que la synaptogenèse et la plasticité synaptique, peuvent être étudiées avec une intensité accrue et une durée expérimentale prolongée.
En outre, il semble que la matrice coralline provoque une augmentation de certaines des fonctions cellulaires des cellules gliales, telles que la croissance, la réactivité et la prolifération. Il est donc possible que ces conditions augmentent également la capacité astrocytaire d’enrichir les milieux de culture neuronale dissociés avec des facteurs trophiques sécrétés, ce qui peut être applicable pour la médecine régénérative du système nerveux central.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le programme KAMIN du ministère israélien du Commerce et du Travail et par Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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