Summary
解離した海馬細胞培養は、神経科学における極めて重要な実験ツールです。サンゴの骨格をマトリックスとして使用すると、神経保護的および神経調節的役割により、培養における神経細胞の生存と機能が強化されます。したがって、サンゴマトリックス上で増殖した神経細胞はより高い耐久性を示し、それによって培養により適しています。
Abstract
解離した海馬の神経細胞とグリア細胞の培養は、高い細胞分離と制御された環境を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです。しかし、in vitroでの海馬細胞の生存は損なわれます:ほとんどの細胞は培養の最初の週に死にます。したがって、培養中の神経細胞の耐久性を高める方法を特定することは非常に重要です。
サンゴの骨格に由来する結晶性アラゴナイトの形の炭酸カルシウムは、神経培養のための優れた活性マトリックスとして使用することができます。グリア細胞を育て、保護し、活性化することにより、サンゴの骨格は他のマトリックスよりもin vitroでこれらの細胞の生存と成長を促進します。
このプロトコルは、サンゴマトリックス上で海馬細胞を培養する方法を記載しています。このマトリックスは、サンゴの骨格の粒を培養皿、フラスコ、ガラスカバーガラスに取り付けることによって生成されます。粒子は、細胞を微細な3次元(3D)環境に導入して成長し、組織のような構造を形成することにより、細胞の環境を改善するのに役立ちます。サンゴの骨格によってもたらされる3D環境は、粉砕によって細胞のために最適化することができ、グリア細胞の活性に影響を与えることがわかっている特性である粒子のサイズと密度(すなわち、マトリックスの粗さ)の制御を可能にします。さらに、穀物を使用すると、特に光学顕微鏡を使用する場合に、培養物の観察と分析が容易になります。したがって、プロトコルには、in vitroで神経細胞の維持と機能を改善するためのツールとして、サンゴマトリックスの生成と最適化の手順が含まれています。
Introduction
解離した神経細胞(この場合は海馬細胞)の培養は、高い細胞分離とアクセス可能性を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです1,2,3。このタイプの培養は、成長速度と生存率、神経毒性、神経突起の成長とネットワーキング、シナプスの接続性と可塑性、形態学的修飾、神経突起の組織と配線など、収集できる大量の情報のために、神経科学、医薬品開発、および組織工学で頻繁に使用されます1,4,5,6,7。
培養の重要性にもかかわらず、培養細胞は通常、2次元単層のガラスカバーガラス上で成長することを余儀なくされる。ガラスカバーガラスは接着強度の低い非育成基板であり、細胞増殖をサポートする能力が低いため、これらの厳密な環境改変は神経細胞の長期生存能力を著しく低下させます8,9,10,11。
培養された神経細胞は困難な条件で成長することを余儀なくされるため、生存率を高めるための不可欠なアプローチは、可能な限り自然環境を模倣することです12,13。これは、マトリックスとして機能し、細胞の細胞外マトリックスを模倣する生体材料を使用して、細胞が組織のような構造を形成し、栄養を助けることを可能にすることによって達成できます14。
生体材料の使用は、生体適合性の足場として機能し、機械的安定性を提供し、接着、生存、増殖、遊走、形態形成、および分化を含むさまざまな細胞特性を強化するため、細胞培養の改善における有望なアプローチです15,16,17。インビトロで細胞の状態を改善するために、いくつかの種類の生体材料が使用されます。それらの中には、生体高分子、または通常細胞の細胞外マトリックスの一部である生物学的成分がある。これらの生体材料は、主に重合コーティング剤またはヒドロゲル18、19、20の形態として使用される。一方では、上記のマトリックスは、細胞に成長するための使い慣れた3D環境を与え、皿への接着を促進し、それらに機械的支持を与える21、22。他方、それらの重合形態およびヒドロゲル内の細胞の閉じ込めは、増殖培地中に存在する育成成分への細胞のアクセスを妨害し、また顕微鏡的方法による細胞のフォローアップをより困難にする23。
サンゴの外骨格は、生物学的海洋起源のマトリックスです。それらは炭酸カルシウムでできており、機械的安定性があり、生分解性です。培養中の神経細胞を成長させるためのマトリックスとしてサンゴ骨格を使用した以前の研究では、ガラスカバーガラスと比較して、はるかに大きな接着性が示されています24,25。さらに、サンゴの骨格上で増殖した神経細胞は、その骨格が構成されているカルシウムを摂取する能力を示し、栄養欠乏の条件下で神経細胞を保護します26。さらに、サンゴの骨格は、神経細胞の生存率を高め、神経ネットワークの形成を促進し、シナプス結合の速度を高め、組織様構造の形成を可能にする支持的で育成的なマトリックスです27,28。最近の研究では、サンゴ骨格マトリックスの表面トポグラフィーがグリア細胞の分布と活性化に重要な役割を果たしていることも示されています8,29。また、サンゴ骨格は、培養中の骨細胞30、31、肝細胞、心筋細胞などの他の細胞種の培養のためのマトリックスとして有効である(未発表データ)。
したがって、サンゴの骨格は、in vitroで細胞を培養するための有望なマトリックスです。したがって、以下に詳述するプロトコルは、既存の方法で達成されたものよりも安定して繁栄した神経培養を生産するために、サンゴの骨格上で神経細胞を培養する技術について説明しています。このプロトコルは、心筋細胞、肝細胞、および他の細胞型の培養にも有用であり得る。
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Protocol
このプロトコルでの動物の使用は、全国動物管理使用委員会によって承認されました。
注:炭酸カルシウムサンゴの骨格は、アラゴナイトの結晶形で使用する必要があります。神経培養のためにこれまでにテストされたサンゴの種類は、 ポリテスルテア、スティロフォラピスティラータ、トラ キフィリアジェフロイです。 スケルトンは全体または地上で購入できます。
1.サンゴの骨格片をきれいにする
注意: 以下の手順は、以下に説明する溶液は危険であり、火傷や刺激を引き起こす可能性があるため、化学薬品フード内で室温で実行する必要があります。
- ハンマーを使ってサンゴの骨格を壊し、それを0.5〜2 cmの断片に分けます。有機および非有機残留物を溶解するには、サンゴの骨格片を10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に10分間浸した後、二重蒸留水(DDW)で1回洗浄します。
- 残りの有機残留物を除去するには、フラグメントを1M NaOH溶液に5分間浸した後、重水素減少水で1回洗浄します。断片を30%H 2 O2溶液に10分間浸すことによって有機堆積物の除去を続け、次いで断片をDDWで3倍洗浄する。
- 余分な重水素減少水をできるだけ取り除き、フード内のサンゴの破片を乾燥させます(1〜8時間)。
2.ガラスカバースリップのクリーニング
- ガラスカバーガラスを100mmのガラス製ペトリ皿に移します。10 mLの95%エタノールを15分間加えます。
- エタノールを取り除き、DDW 3xで洗浄し、各洗浄の間に10分間待ちます。DDWが蒸発するまで、80°Cに予熱した加熱プレートに皿を置きます。乾燥中にプレート内のカバーガラスを数回静かにかき混ぜて、互いにくっつかないようにします。
- カバーガラスをオートクレーブします。
3.サンゴ骨格粒の調製
- 完全に壊れるまで、乳鉢と乳棒(手動粉砕)を使用してサンゴの骨格の破片を粉砕します。結果は、20μm〜200μmの範囲のサイズの粒子の混合物です。
- または、電気粉砕機を使用して、1,000 rpmの速度で30秒間、サンゴの骨格の破片を粉砕します(ブレードの長さ= 6 cm、幅= 0.5 cm–1.0 cm)。結果として得られる粒径は、手動粉砕によって生成されるサイズ範囲と同様である。
4.特定のサイズ範囲の穀物の精製
注意: マトリックス内の粒子のサイズを制御する必要がある場合は、次のろ過ベースの粒子精製手順を使用します。
- グレインを手動または電気式の40 μmフィルターメッシュストレーナーに移します。
- ストレーナーを通して粒子をふるいにかけて、粒子を2つの特定の範囲に分割します(電気ストレーナーを使用する場合は、次の条件をお勧めします:振とう= 600振幅/分、バウンス= 6 / s)。この手順では、1つは<40 μm、もう1つは>40 μmの2つのグループの粒径を生成します。
注: 2 つのサイズは、さまざまなメッシュのストレーナーを使用して決定できます。より制限された範囲が必要な場合は、ステップ4.2から異なるメッシュのストレーナーを通して各グループを再ふるいにかけます。 - 穀物をオートクレーブします。
5.サンゴの穀物でコーティングされた皿またはカバーガラスの準備
- フラスコ、プレート、またはペトリ皿のコーティング用
注意: 次の手順は、無菌条件下で実行する必要があります。- サンゴの骨格粒子をハンクス溶液に溶解した20 μg/mLのポリ-D-リジン(PDL)溶液に加えます。推奨される濃度は、1 mL PDL溶液あたり5 mg / 10 mgの穀物です。
- 溶液をフラスコとディッシュ(約2 mL/25 cm2)に注ぎ、4°Cで一晩インキュベートします。 穀物は沈み、底に付着します。
- 翌日、フラスコと皿を滅菌重水素減少水で一度洗います。フラスコと皿をフードで乾かします。
注:コーティングしたばかりのフラスコと皿を使用することが好ましい。コーティングされたフラスコとディッシュは、4°Cで保存すれば、コーティング後1週間まで使用できます。 ただし、マトリックスの有効性が損なわれる可能性があります。
- コーティングガラスカバースリップ(直径12mm、厚さ0.17mm)
- サンゴの骨格粒子を任意の所望の濃度で重水素減少水に加える。神経細胞に使用される一般的な密度は、5 mg / mLおよび10 mg / mLです。カバーガラスの中央に40 μLの穀物溶液を注ぎます(図4)。
- カバーガラスを80°Cに予熱した加熱プレートに置き、完全に蒸発するのを待ちます(通常15分)。これらの条件下では、穀物はカバーガラスに付着します。コーティングされたカバースリップをオートクレーブします。無菌状態で保管してください。
- 培養の前日に、滅菌済みの24ウェルプレートの蓋にカバーガラスを置きます。各カバーガラスに100 μLの20 μg/mL PDL溶液を加えます。先端を使用して、液体が粒子領域全体とカバーガラス表面の残りの部分を覆っていることを確認します。
- プレートの底で蓋をします。プレートの側面をパラフィンフィルムで包みます。4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、重水素減少水で一度洗い、フードで乾かします。
注意: 新しくコーティングされたカバーガラスを使用することをお勧めします。
6. サンゴ骨格粒子被覆ガラスカバーガラス上での海馬解離細胞の培養
注:海馬解離細胞培養の方法は、以前に公開された手順24、27から変更されました。培養物の調製は、4匹のラットの仔について記載されている。各海馬からの期待収量は1〜1.5 x 106 細胞です。
- セットアップ
- 空の60 mmペトリ皿を準備します。2 mLの最小必須培地(MEM)を60 mmのペトリ皿に注ぎ、氷の上に置きます。
- 2 mLのMEMを35 mmディッシュに注ぎ、37°C、5〜10%CO2のインキュベーターに入れます。2 mLのMEMを15 mLのチューブに注ぎ、4°Cに保ちます。
- 1 mLの初日培地を15 mLチューブに注ぎ、37°C、5〜10%CO2のインキュベーターに入れます。
注:初日培地の組成は、 材料の表に記載されています。 - 200 μLの2.5%トリプシン溶液を解凍し、37°Cでインキュベートします。
- 炎を使用して、直径0.5 mm、0.75 mm、および1.0 mmのヘッドを備えた3つのガラスパスツールピペットを準備します。
- 大きなハサミ1本、小さなハサミ2本、大きなピンセット1本、小さなピンセット4本、メス1本など、適切な手術器具を準備します。
- フードに実体顕微鏡を用意します。
- 大きなはさみを使用して、0〜3日齢のSprague Dawleyラットの子犬を、頭を体から切り離して空の60mmペトリ皿に犠牲にします(ステップ6.1.1)。遺体を処分します。
- 大きなピンセットで口から頭を持って頭を持ち上げます。小さなハサミで頭蓋骨を覆っている皮膚を切ります。
- きれいなはさみで頭蓋骨の下(小脳の側面)に入り、頭蓋骨を右と左に切断して除去できるようにします。小さなピンセットを使用して、頭蓋骨を脳から剥がします。
- きれいなピンセットで脳を頭から分離し、60 mLの冷たいMEMを含む2 mmのペトリ皿に入れます(手順6.1.2を参照)。
- 2本の小さなピンセットを使用して、実体顕微鏡下で海馬を解剖します。海馬をMEMを含む準備された35 mmディッシュ(ステップ6.1.2から)に移します。
注意: 子犬ごとに手順6.3〜6.6を繰り返す必要があります。 - メスを使って海馬を約1mmスライスに切ります。200μLのトリプシン溶液(最終濃度0.25%に希釈)を加える。穏やかに混合し、37°C、5〜10%CO2 で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、2 mLのコールドMEM(ステップ6.1.2)をディッシュに追加して、トリプシンを失活させます。最大径のガラスパスツールピペットを使用して(ステップ6.1.5)、37°Cに予熱した1 mLの初日培地(ステップ6.1.3)を含む15 mLチューブにトリプシン処理組織を移します。
注:組織のさらなる処理に最適な培地と組織の比率(v:v)は、1 mL / 8海馬です。培地を組織と一緒に移すことはできるだけ避けてください。 - 組織を最大直径のガラスピペットに10〜15回通して粉砕します。次に、中径のガラスピペットを使用してこのプロセスを繰り返します。最小直径のピペットで粉砕を続けます。細胞死を減らすために泡立ちを避けてください。
- 残りの組織片を2〜5分間沈め、上清を別の15 mLチューブに移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
注:好ましい細胞密度は200,000〜400,000細胞/ mLです。First Day 培地を使用して、470 x g で希釈または遠心分離し、細胞を濃縮します。 - 各ガラスカバーガラスに100 μLの細胞を播種します。播種中は、カバーガラス全体を細胞で覆うようにしてください。37°C、5〜10%CO2でインキュベートします。
- 翌日、500 μLの神経細胞成長培地をウェルに加えます。
注:神経細胞成長培地の組成は、 材料の表に記載されています。 - ピンセットを使用して各カバーガラスを適切なウェルにそっと移し、カバーガラスを傾けて初日培地を取り外します。蓋から残りのメディアを吸引します。
- 37°C、5〜10%CO 2でインキュベートします。 インキュベーション中は培地の交換を避けてください。 培養はこれらの条件下で1ヶ月まで維持することができる。主な懸念は湿度です。したがって、インキュベーターを最大限に加湿した状態に維持するようにしてください。
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Representative Results
サンゴ骨格マトリックスを調製するために、サンゴ骨格全体(図1A)をハンマーを使用して0.5〜2 cmの断片に分割し(図1B)、10%次亜塩素酸塩溶液、1M NaOH溶液、および30%H2O2溶液(図1C)を使用して3つのステップ(プロトコルのステップ1)を通じて有機残留物から完全に洗浄しました。サンゴの破片は、骨格の色が茶色(図1D)から白(図1E)に変わったときによく洗浄されました。次に、洗浄した小片(図2A)を乳鉢と乳棒(図2B)または電気粉砕機(図2C)のいずれかを使用して粉砕しました。どちらの手順でも同様の結果が得られました:サイズが20μm〜200μmの範囲の粒子の混合物(図2D-G)。
可溶性基質に対するグレインマトリックスの利点の1つは、その構造的および物理的特性のいくつかを変更できるため、より定量的になることです。このサンゴの骨格粒子マトリックスでは、粒子サイズと粒子密度という2つの粒子混合物特性が操作されました。上記の粉砕手順によって生成される20 μm〜200 μmのサイズの多様性を減らすために、40 μmのフィルターメッシュを使用したふるい分けアプローチが選択されました。手動(図3 A–D)または電気(図3E)のストレーナーを使用して、サイズが40 μm〜200 μmの範囲の粒子(図3 F、H)と40 μm以下のサイズ(図3G、I)の2種類の粒子混合物が製造されました。カバーガラスと皿をコーティングする粒子の密度は、さまざまな量の粒子を塗布し、熱によってカバーガラスに取り付けるか(図4C)、重力によってフラスコと皿に取り付ける(図4H)だけで決定されました。このようにして、低密度(図4 D、F、I)と高密度(図4E、G、J)の行列が生成されました。
図5は、<40 μm(10 mg/mL)のサンゴ骨格粒でコーティングされたカバーガラス上で海馬細胞を培養した結果を示しています。位相差顕微鏡写真は、細胞がマトリックスの非存在下(図5A)および存在下(図5B)で複雑なニューラルネットワークを形成したことを示しています。細胞核染色(図5C、D)は、播種後14日目に、コーティングされていないカバーガラスよりもマトリックス上の細胞密度が高いことを示しました。微小管関連タンパク質2(MAP2)による染色は、対照(図5E)と比較して、マトリックス上に複雑なニューロンおよび樹状突起ネットワークが形成されていることを示した(図5F)。さらに、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)を用いて可視化されたサンゴ骨格マトリックス上に増殖したグリア細胞は、有意な形態変化を受けた。それらは、対照基質上で増殖したグリア細胞よりも長いプロセスでよりスパイキーな外観を獲得し、丸くて平らに見えました(図5G、H)。
図1:サンゴの骨格の清掃。 (A)サンゴの スチロフォラ・ピスティラータの骨格。(B)洗浄前に骨格の破片を分解した。(C)次亜塩素酸塩溶液で処理した後の(B)由来の断片を、水酸化ナトリウム、過酸化水素とする。(D)(B)に示す未洗浄断片の拡大。(E)(C)に示す洗浄断片の拡大。スケール:A = 20ミリメートル;B、C = 10ミリメートル;D,E = 3 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サンゴの骨格を粉砕する。 (A)きれいにしたサンゴの骨格の破片。(B)手動粉砕に使用される乳鉢と乳棒。赤い矢印は、結果の粒子を指します。(C)研削盤。赤い矢印は、結果の粒子を指します。(D)手挽き後の穀物。(E)機械的粉砕後の穀物。(F)(D)の拡大。(G)(E)の拡大。スケール:A = 15ミリメートル;D、E = 3ミリメートル;F,G = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:粒度の制御。 (A-D)手動の緊張手順。(A)40μmのストレーナーを使用する。(B)ひずみのない粉砕粒を含むストレーナーを50mLチューブに入れ、ボルテックスを使用して濾します。(C)50 mLチューブの底にある<40 μmの粒子を濾します。(D)メッシュと類似した最小サイズの粒子(>40μm、黄色矢印)。(E)サイズが20μm〜200μmの粒子の混合物から<40μmの粒子を濾すために使用される機械的ストレーナー。(F)ひずみ前の研削後の多様な粒径のデモンストレーション。(G)40μm<ひずみ粒のデモンストレーション。 (H)(F)の拡大。(I)(G)の拡大。スケール:F、G = 900 μm;H,I = 300 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マトリックスの密度の制御。 (A)カバーガラスの場合は重水素減少水で10 mg / mLに希釈された<40 μmの粒子を含む1.5 mLの遠沈管、その他の皿の場合はPDL。(B)40 μLの10 mg/mL溶液を含むガラスカバーガラス。(C)40 μLの10 mg/mL溶液を80°Cに予熱したホットプレートで乾燥させたカバーガラスで、穀物がカバーガラスに付着できるようにします。(D)重水素減少水蒸発後の粒子濃度5 mg / mLのコーティングされたカバーガラス。(E)重水素減少水蒸発後の粒子濃度10 mg / mLのコーティングされたカバーガラス。(F)(D)の拡大。(G)(E)の拡大。(H)T-25フラスコ、60 mmプレート内の10 mg/mL溶液。(I)フラスコに5 mg/mLの濃度の穀物をコーティングします。(J)フラスコに10 mg/mLの濃度の穀物をコーティングした。スケール: B,D,E,I,J = 3 mm;F,G = 600 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:サンゴ骨格マトリックス上での海馬神経細胞の培養。 画像は、0〜3日齢のラットの子犬海馬から抽出し、14日間培養し、GFAP(赤、グリア細胞)、MAP2(緑、神経細胞体および樹状突起)、DAPI(青、細胞核)で染色した細胞を示しています。(a)マトリックスの非存在下での細胞の位相差像。(B)サンゴ骨格マトリックス上に増殖した細胞の位相差像。(C)DAPIで染色したマトリックスなしで増殖した細胞。(d)DAPIで染色したサンゴ骨格マトリックス上で増殖した細胞。(e)マトリックスの非存在下で増殖した細胞をMAP2について染色した。(f)MAP2について染色されたサンゴ骨格マトリックス上で増殖した細胞。(g)GFAPで染色されたマトリックスなしで増殖した細胞。(h)サンゴ骨格マトリックス上で増殖した細胞をGFAPで染色する。(I) (C)、(E)、(G)のマージ画像。(J) (D)、(F)、(H)の画像が合成されました。スケール = 40 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する手法は、培養中の神経細胞の維持と機能を改善する方法を説明しています。これは、細胞を育成し、その成長と活動を促進するサンゴの骨格粒子で作られたマトリックスに細胞を接着することによって達成されます。この手法を使用すると、脳内の細胞の環境を模倣する神経培養モデルの能力が向上します。
培養基質としてのマトリックスの導入は、古典的な神経細胞培養方法で使用される他の基質に比べていくつかの利点を有する。第一に、それは細胞接着を増加させる。サンゴの骨格とPDLの組み合わせは、ガラスとPDL(図示せず)よりも強い接着性を生じる。このような接着性の増加は、培養32における接着性非浮遊細胞の生存に必須であることが示された。第二に、サンゴの骨格粒子の炭酸カルシウム結晶は、実際に細胞に吸収されるカルシウムイオンの供給源です。これが、サンゴ骨格マトリックス上に示された神経細胞の耐久性の向上と密度の増加(図5 C、D)の理由である可能性が高いです(図5C、D)は、サンゴの骨格マトリックスがない場合の生存レベルと比較して26。
3番目の利点は、ガラスのカバーガラスとは異なり、サンゴの骨格マトリックスが実際には非平面であるという事実にあります。粒子は、複雑な曲面構造で3D構造されています。これらの構造特性は、細胞がさまざまな形態、寸法、および密度の粒子集団に直面していることを考えると異なります。このような粗く非平面的な培養物質は、古典的な平らなカバーガラスよりもin vivoでの細胞の環境をよりよく模倣します。実際、サンゴの骨格の粗さ、サイズ、形態が細胞の分布、生存、および活動に影響を与えることを示しました8,26,29。
さらに、サンゴの骨格マトリックスが微小環境として細胞に提供する3D構成は、in vitroでの3D成長に使用される従来のヒドロゲルマトリックスとは大きく異なります。コラーゲンおよびヒアルロン酸などのヒドロゲルを使用する場合、細胞はゲル23内に埋め込まれる。ゲルは、空間充填、剛性、およびその他の属性の点で細胞外マトリックスに似ていますが、ゲルの粘度のために、これらの培養物は細胞を十分に栄養状態に保つために複雑な供給システムを必要とします21,22。対照的に、サンゴの骨格の3D粒子は、細胞が培養液に対して完全に開放されている表面を占めることを可能にします。さらに、ヒドロゲル培養とは対照的に、サンゴ骨格マトリックス上の細胞は、位相顕微鏡および蛍光顕微鏡によって容易にモニターされる。
この手法にはいくつかの制限があります。上記の利点にもかかわらず、サンゴの骨格は生体材料であり、製造されたり死んだサンゴから収集されたりすることはできず、マトリックスの供給に制限がありますが、一部は市販されています。また、複数のサンゴ種の骨格を使用すると、培養特性にばらつきが生じる可能性があります。一方、サンゴの骨格結晶はすべてアラゴナイトという1つの物質でできており、粒子のサイズを制御できるという事実は、マトリックス間の化学的および構造的多様性のほとんどを排除します。テストされたすべての生体材料の粒子は、細胞を3次元的に成長させるのに十分な大きさです。細胞は粒子8に登り、結晶33 の先端に付着して成長し、粒子間27を交差させる。あるいは、化石堆積物と合成炭酸カルシウムで作られた地質学的アラゴナイトが市販されており、マトリックスとして使用できます。ただし、ガラスカバースリップへの接着性が低下する場合があります。
複数のサンゴ種を使用することを考慮して、いくつかの研究はサンゴのバイオミネラリゼーションの証拠を示しており、炭酸カルシウム結晶の間に多様な有機堆積物が存在する可能性があることに注意することが重要です。これらは、このプロトコル33、34に記載されている洗浄プロセスを使用して除去することはできません。この事実は、生物学的応用のための生体材料を特定する際に非常に重要です。この研究の場合、足場の均質性を可能な限り確保するために、いくつかのステップが以前に実行されました。まず、ポリテス・ルテア、スティロフォラ・ピスティラータ、トラキフィリア・ジェフロワの3種類のサンゴをマトリックスでテストしました。これらのサンゴ骨格上の神経細胞の成長および生存に関して有意な変化はなかった。この結果は、この場合、骨格内の異なる有機堆積物が有意な影響を及ぼさないことを示している可能性があります。第二に、きれいなサンゴ骨格のフーリエ変換赤外分光法は、有機残留物の欠如を示した29。
プロトコルには、考慮すべき重要なステップがいくつかあります。まず、穀物を手動でふるいにかけている間、ストレーナーが詰まる傾向があるため、時々ストレーナーを交換することをお勧めします。電気ストレーナーは、ふるい分け中により大きな力を使用します。したがって、目詰まりしにくい傾向があります。第二に、PDLとサンゴの穀物混合物を皿やカバーガラスに分散させながら、穀物の沈み込みを避けるために混合物を頻繁にピペットで打つことが重要です。それは溶液の均質な分散を確実にするでしょう。カバーガラスへの穀物の取り付けプロセスに注意を払うことが重要です。ガラスカバースリップへの穀物の取り付け中の不適切な加熱温度、振動、およびその他の要因により、細胞播種の前後に粒子が剥離する可能性があります。温度を注意深く制御し、振動を最小限に抑えることで、この問題を解決することをお勧めします。さらに、フラスコやディッシュに塗布してから設定した時間に実験を行うことが好ましい。培養の前日に皿を塗りたての方が良いです。PDLと穀物混合物との皿の長時間のインキュベーションは、皿に付着する穀物の量に多様性をもたらし得る。
上記の技術のいくつかの変更は、培養細胞の必要性に応じて可能である。サンゴの骨格マトリックスは、培養中の神経細胞の成長を改善する能力に加えて、骨細胞30、31、肝細胞、および心筋細胞の増殖をサポートします(未発表データ)。他の細胞タイプの培養耐久性を高めるために、異なるサンゴタイプの骨格に対する最も強い細胞反応をチェックし、粒子のサイズと密度を最適化することをお勧めします。
追加のコーティングなしで、粒子上で直接神経細胞を成長させることも可能である。しかしながら、このプロトコル(ステップ5)で述べたように、PDLによる粒子のプレコーティングは、PDL被覆ガラスで得られるレベルよりも、神経細胞の接着および生存を高度に改善する。異なる細胞型の好みに応じて他のコーティング材料を使用することも可能である。
マトリックス内の粒子のサイズは限られていることは言及する価値があります。約200μmの特定のしきい値を超えると、それらをガラスカバーガラスに結合することが困難になります。したがって、マトリックス表面の粗さは有限の範囲を有する。より大きな粒子または骨格片を必要とする実験は、この手法には適していません。おそらく接着剤やゲルを使用して、より大きな粒子を取り付ける別の方法を見つけるかもしれませんが、これは粒子との細胞接触を覆い隠す可能性があります。別の可能性は、粉砕せずに骨格上で直接細胞を培養することである。この方法は、細胞播種手順24、27の修正を必要とする。非地上サンゴ骨格の3D構造は、26以前に報告したように、神経細胞の生存に寄与しています。しかしながら、そのような複雑で緻密なマトリックスは顕微鏡検査作業を困難にする。粉砕骨格の妥協されたセットアップは、骨格の化学的特性を維持し、2D顕微鏡分析を可能にし、粒子のサイズが大きいため、細胞を3D8で強制的に成長させます。
さらに、過剰なサンゴ骨格粒は有毒である可能性があります。上述したように、サンゴ骨格マトリックスのカルシウム成分は細胞35に吸収される。高い粒子密度によって引き起こされるカルシウム過剰は、神経細胞36の場合のように、いくつかの細胞型に対する負担またはさらには抑制性であり得る。したがって、粒子密度の低減が必要となり、セルタイプごとに最適化され得る。さらに、サンゴの骨格の可用性が制限される可能性があることを覚えておくことが重要です。サンゴは水槽や自然環境でゆっくりと成長します。地球温暖化と海洋酸性化の結果として、それらの成長はさらに妨げられています37。したがって、サンゴの骨格の豊富さと入手可能性は限られています。
培養中のサンゴ骨格粒子と接触したときに解離した神経細胞が強化されることで、神経生物学の研究に新たな道が開かれます。細胞の成長、神経炎の伸長と分岐、シナプス形成とシナプス可塑性は、強度を高め、実験期間を延長して研究することができます。
また、サンゴマトリックスは、成長、反応性、増殖など、グリア細胞の細胞機能の一部を増加させるようです。したがって、これらの条件は、解離した神経培養培地を分泌された栄養因子で濃縮する星状細胞能力も増加させる可能性があり、中枢神経系の再生医療に適用できる可能性があります。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益がないことを宣言しています。
Acknowledgments
この作業は、イスラエル貿易労働省のKAMINプログラムとQrons Inc.(777 Brickell Avenue Miami、FL 33131、US)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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