Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Ariel University

Summary

תרבית תאי היפוקמפוס מנותקת היא כלי ניסויי מרכזי במדעי המוח. הישרדות התאים העצביים ותפקודם בתרבית משופרים כאשר שלדי אלמוגים משמשים כמטריצות, בשל תפקידיהם הנוירו-פרוטקטיביים והנוירומודולטיביים. לפיכך, תאים עצביים הגדלים על מטריצת אלמוגים מראים עמידות גבוהה יותר, ולכן הם מתאימים יותר לתרבית.

Abstract

תרביות של תאי עצב וגליה מנותקים בהיפוקמפוס הן מודל ניסיוני רב ערך לחקר גדילה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה וסביבה מבוקרת. עם זאת, הישרדותם של תאי היפוקמפוס במבחנה נפגעת: רוב התאים מתים במהלך השבוע הראשון של התרבית. לכן יש חשיבות רבה לזהות דרכים להגביר את עמידות התאים העצביים בתרבית.

סידן פחמתי בצורת אראגוניט גבישי המופק משלד של אלמוגים יכול לשמש כמטריצה מעולה ופעילה עבור תרביות עצביות. על-ידי טיפוח, הגנה והפעלה של תאי גלייה, שלד האלמוגים משפר את ההישרדות והגדילה של תאים אלה במבחנה טוב יותר מאשר מטריצות אחרות.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיפוח תאי היפוקמפוס על מטריצת אלמוגים. מטריצה זו נוצרת על ידי הצמדת גרגרי שלדי אלמוגים לצלחות תרבית, צלוחיות וכיסויי זכוכית. הגרגרים מסייעים בשיפור הסביבה של התאים על ידי הצגתם לסביבה תלת ממדית עדינה (3D) לגדול עליה וליצור מבנים דמויי רקמות. הסביבה התלת-ממדית שמציג שלד האלמוגים ניתנת לאופטימיזציה עבור התאים על ידי טחינה, המאפשרת שליטה על גודל וצפיפות הגרגרים (כלומר, חספוס המטריצה), תכונה שנמצאה כמשפיעה על פעילות תאי גלייה. יתר על כן, השימוש בדגנים מקל על התצפית והניתוח של התרביות, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ אור. לפיכך, הפרוטוקול כולל נהלים ליצירה ואופטימיזציה של מטריצת האלמוגים ככלי לשיפור התחזוקה והפונקציונליות של תאים עצביים במבחנה.

Introduction

תרביות של תאים עצביים מנותקים, במקרה זה תאי היפוקמפוס, הן מודל ניסויי רב ערך לחקר צמיחה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה ונגישות 1,2,3. סוג זה של תרבית משמש לעתים קרובות במדעי המוח, פיתוח תרופות והנדסת רקמות בשל כמות המידע הגדולה שניתן לאסוף, כגון שיעורי גדילה וכדאיות, רעילות עצבית, צמיחת עצבים ורשתות, קישוריות סינפטית ופלסטיות, שינויים מורפולוגיים, ארגון וחיווט של נוירוטים וכו '.1,4,5,6,7.

למרות חשיבותן של התרביות, התאים המתורבתים נאלצים בדרך כלל לגדול על כיסויי זכוכית בחד-שכבה דו-ממדית. שינויים סביבתיים מחמירים אלה מפחיתים באופן משמעותי את יכולתם של תאים עצביים לשרוד לאורך זמן, מכיוון שכיסויי זכוכית הם מצעים שאינם מזינים עם חוזק הדבקה נמוך, ומציגים יכולת נמוכה יותר לתמוך בצמיחת תאים 8,9,10,11.

מכיוון שתאים עצביים מתורבתים נאלצים לגדול בתנאים מאתגרים, גישה חיונית לשיפור הישרדותם תהיה לחקות את סביבתם הטבעית ככל האפשר12,13. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בביו-חומרים שישמשו כמטריצות ויחקו את המטריצה החוץ-תאית של התאים, מה שיאפשר להם ליצור מבנה דמוי רקמה ולסייע בהזנתם14.

השימוש בביו-חומרים הוא גישה מבטיחה לשיפור תרביות תאים, מכיוון שהם פועלים כפיגומים תואמים ביולוגית, מספקים יציבות מכנית ומשפרים מגוון תכונות תאים, כולל הידבקות, הישרדות, התפשטות, נדידה, מורפוגנזה והתמיינות15,16,17. מספר סוגים של ביו-חומרים משמשים לשיפור התנאים של התאים במבחנה. ביניהם ביופולימרים, או רכיבים ביולוגיים שהם בדרך כלל חלק מהמטריצה החוץ תאית של התאים. ביו-חומרים אלה משמשים בעיקר כצורה של חומרי ציפוי פולימריים או הידרוג'לים18,19,20. מצד אחד, המטריצות שהוזכרו לעיל מעניקות לתאים סביבה תלת-ממדית מוכרת לגדול בה, מעודדות את היצמידותם לצלחת, ונותנות להם תמיכה מכנית21,22. מצד שני, צורתם הפולימרית וכליאת התאים בתוך הידרוג'לים מפריעה לגישה של התאים לרכיבים מזינים הקיימים במצע הגידול וגם מקשה על מעקב התאים בשיטות מיקרוסקופיות23 .

שלד חיצוני של אלמוגים הוא מטריצות ביולוגיות שמקורן בים. הם עשויים סידן פחמתי, יש יציבות מכנית, והם מתכלים. מחקרים קודמים שהשתמשו בשלד האלמוגים כמטריצה לגידול תאים עצביים בתרבית הראו הידבקות הרבה יותר גדולה, בהשוואה לכיסויי זכוכית24,25. בנוסף, תאים עצביים הגדלים על שלד אלמוגים הדגימו את יכולתם לצרוך את הסידן ממנו מורכב השלד, המגן על התאים העצביים בתנאים של מחסור בחומרי מזון26. יתר על כן, שלד האלמוגים הוא מטריצה תומכת ומטפחת המגבירה את הישרדות התאים העצביים, מעודדת היווצרות רשתות עצביות, מעלה את קצב הקישוריות הסינפטית, ומאפשרת היווצרות מבנים דמויי רקמה27,28. מחקרים אחרונים הראו גם כי טופוגרפיית פני השטח של מטריצת שלד האלמוגים ממלאת תפקיד מכריע בהפצה ובהפעלה של תאי גלייה 8,29. כמו כן, שלד האלמוגים יעיל כמטריצה לגידול סוגי תאים אחרים, כגון אוסטיאוציטים30,31, הפטוציטים וקרדיומיוציטים בתרבית (נתונים שלא פורסמו).

לפיכך, שלד אלמוגים הוא מטריצה מבטיחה לטיפוח תאים במבחנה. לפיכך, הפרוטוקול המפורט להלן מתאר את הטכניקה של טיפוח תאים עצביים על שלד אלמוגים לייצור תרביות עצביות יציבות ומשגשגות יותר מאלה שהושגו בשיטות קיימות. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי גם לטיפוח קרדיומיוציטים, הפטוציטים וסוגי תאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה הלאומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

הערה: יש להשתמש בשלדי אלמוגים עם סידן מוגז בצורה גבישית של ארגוניט. סוגי האלמוגים שנבדקו עד כה לתרביות עצביות הם Porites Lutea, Stylophora Pistillata ו-Trachyphyllia Geoffroyi. את השלדים ניתן לרכוש בשלמותם או בקרקע.

1. ניקוי חלקי שלד האלמוגים

אזהרה: יש לבצע את השלבים הבאים במכסה מנוע כימי בטמפרטורת החדר, מכיוון שהתמיסות המתוארות להלן מסוכנות ועלולות לגרום לכוויות וגירויים.

  1. השתמשו בפטיש כדי לשבור את שלד האלמוג ולחלק אותו לשברים של 0.5–2 ס"מ. על מנת להמיס שאריות אורגניות ולא אורגניות, השרו את שברי שלד האלמוגים בתמיסת נתרן היפוכלוריט 10% למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים כפול (DDW).
  2. כדי להסיר את השאריות האורגניות הנותרות, השרו את השברים בתמיסת NaOH בגודל 1M למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו פעם אחת עם DDW. המשך עם הסרת הפיקדונות האורגניים על ידי השריית השברים בתמיסת 30% H 2O2 למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף את השברים 3x עם DDW.
  3. הסר כמה שיותר DDW עודף ולהשאיר את שברי האלמוגים במכסה המנוע להתייבש (1-8 שעות).

2. ניקוי כיסויי הזכוכית

  1. מעבירים את כיסויי הזכוכית לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 100 מ"מ. מוסיפים 10 מ"ל אתנול 95% למשך 15 דקות.
  2. מוציאים את האתנול ושוטפים עם DDW 3x, ממתינים 10 דקות בין כל כביסה. מניחים את המנה על צלחת חימום שחוממה מראש בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שה-DDW מתאדה. ערבבו בעדינות את הכיסויים בתוך הצלחת מספר פעמים תוך כדי ייבוש כדי למנוע מהם להידבק זה לזה.
  3. בצע אוטוקלאבל של הכיסויים.

3. הכנת גרגרי שלד אלמוגים

  1. טוחנים את שברי שלד האלמוגים באמצעות חומר מליטה ופשטה (השחזה ידנית) עד לפירוק מלא. התוצאה היא תערובת של גרגרים בגדלים הנעים בין 20 מיקרומטר ל-200 מיקרומטר.
  2. לחילופין, טוחנים את שברי שלד האלמוגים באמצעות מכונת השחזה חשמלית במהירות של 1,000 סל"ד למשך 30 שניות (אורך להב = 6 ס"מ; רוחב = 0.5 ס"מ – 1.0 ס"מ). גודל הגרגר המתקבל דומה לטווח הגדלים המיוצר על ידי הטחינה הידנית.

4. טיהור דגנים בטווח גודל מסוים

הערה: אם יש צורך בשליטה על גודל הגרגרים במטריצה, השתמש בהליך טיהור הדגנים מבוסס הסינון הבא.

  1. העבירו את הגרגרים למסננת רשת ידנית או חשמלית עם מסנן 40 מיקרומטר.
  2. חלקו את הגרגרים לשני טווחים ספציפיים על ידי סינון הגרגרים דרך המסננת (אם משתמשים במסננת חשמלית, מומלץ להשתמש בתנאים הבאים: ניעור = 600 אמפליטודות לדקה, הקפצה = 6/s). הליך זה מייצר שתי קבוצות של גדלי גרגרים, האחת <40 מיקרומטר, והשנייה >40 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לקבוע את שני הגדלים באמצעות מסננות של רשתות משתנות. אם רוצים טווח מוגבל יותר, יש לסנן מחדש כל קבוצה משלב 4.2 באמצעות מסננות עם רשתות שונות.
  3. Autoclave את הגרגרים.

5. הכנת כלים מצופים גרגרי אלמוגים או כיסויים

  1. לציפוי צלוחיות, צלחות או צלחות פטרי
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.
    1. הוסיפו את גרגרי שלד האלמוגים לתמיסת פולי-D-ליזין (PDL) של 20 מיקרוגרם/מ"ל המומסת בתמיסה של הנקס. הריכוז המומלץ הוא 5 מ"ג/10 מ"ג דגנים לכל 1 מ"ל תמיסת PDL.
    2. יוצקים את התמיסה לצלוחיות ולכלים (כ-2 מ"ל/25 ס"מ2) ודגרים למשך הלילה ב-4°C. הגרגרים שוקעים ומתחברים לתחתית.
    3. למחרת, שטפו את הצלוחיות והכלים פעם אחת עם DDW סטרילי. תנו לצלוחיות ולכלים להתייבש במכסה המנוע.
      הערה: עדיף להשתמש בצלוחיות וכלים מצופים טריים. ניתן להשתמש בצלוחיות ובכלים המצופים עד שבוע לאחר הציפוי אם נשמרים ב -4 מעלות צלזיוס. עם זאת, האפקטיביות של המטריצה עלולה להיפגע.
  2. ציפוי כיסויי זכוכית (קוטר 12 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ)
    1. הוסיפו גרגרי שלד אלמוגים ל-DDW בכל ריכוז רצוי. הצפיפויות הנפוצות המשמשות לתאים עצביים הן 5 מ"ג/מ"ל ו-10 מ"ג/מ"ל. שפכו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגרגרים על מרכז הכיסוי (איור 4).
    2. הניחו את החלקות על פלטת חימום שחוממה מראש ל-80°C והמתינו לאידוי מלא (בדרך כלל 15 דקות). בתנאים אלה, הגרגרים נצמדים לכיסוי. Autoclave את הכיסויים המצופים. יש לאחסן בתנאים סטריליים.
    3. יום לפני התרבית, מניחים את הכיסויים על מכסה של צלחת סטרילית 24 בארות. הוסף 100 μL של תמיסת PDL של 20 מיקרוגרם/מ"ל לכל כיסוי. השתמש בקצה כדי להבטיח שהנוזל מכסה את כל אזור הגרגר ואת שאר משטח הכיסוי.
    4. מכסים את המכסה בתחתית הצלחת. עוטפים את דפנות הצלחות בסרט פרפין. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
    5. למחרת, יש לשטוף פעם אחת עם DDW ולייבש במכסה המנוע.
      הערה: עדיף להשתמש בכיסויים מצופים טריים.

6. טיפוח תאים מנותקים בהיפוקמפוס על כיסויי זכוכית מצופים גרגרי שלד אלמוגים

הערה: השיטה לתרבית תאים מנותקת בהיפוקמפוס שונתה מהליכיםשפורסמו בעבר 24,27. הכנת התרבית מתוארת עבור ארבעה גורי חולדות. התפוקה הצפויה מכל היפוקמפוס היא 1-1.5 x 106 תאים.

  1. ההתקנה
    1. מכינים צלחת פטרי ריקה בקוטר 60 מ"מ. יוצקים 2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM) לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ ולשים על קרח.
    2. יוצקים 2 מ"ל של MEM לתוך צלחת 35 מ"מ ולשים אותו באינקובטור ב 37 ° C, 5-10% CO2. יוצקים 2 מ"ל MEM לתוך צינור 15 מ"ל ולשמור אותו על 4 ° C.
    3. יוצקים 1 מ"ל של יום ראשון בינוני לתוך צינור 15 מ"ל ולשים אותו באינקובטור ב 37 ° C, 5-10% CO2.
      הערה: הרכב מדיום היום הראשון מתואר בטבלת החומרים.
    4. להפשיר 200 μL של תמיסת טריפסין 2.5% ולדגור ב 37 ° C.
    5. הכינו שלוש פיפטות פסטר מזכוכית עם ראשי פסטר בקוטר 0.5 מ"מ, 0.75 מ"מ ו-1.0 מ"מ באמצעות להבה.
    6. הכינו כלי ניתוח מתאימים: מספריים אחד גדול, שני מספריים קטנים, טוויטר אחד גדול, ארבע פינצטות קטנות ואזמל אחד.
    7. הכינו סטריאומיקרוסקופ במכסה המנוע.
  2. בעזרת מספריים גדולים, הקריבו גורי חולדות ספראג דולי בני 0-3 ימים על ידי הפרדת ראשיהם מגופם לצלחת פטרי ריקה בקוטר 60 מ"מ (שלב 6.1.1). השליכו את הגופות.
  3. הרימו את הראש על ידי החזקתו מהפה עם טוויטר גדול. חותכים את העור המכסה את הגולגולת עם מספריים קטנים.
  4. בעזרת מספריים נקיים נכנסים מתחת לגולגולת (בצד המוח הקטן) וחותכים את הגולגולת ימינה ושמאלה כדי לאפשר את הסרתה. בעזרת טוויטר קטן, מקלפים את הגולגולת מהמוח.
  5. בעזרת טוויטר נקי, הפרידו את המוח מהראש והכניסו אותו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 2 מ"ל MEM קר (ראו שלב 6.1.2).
  6. בעזרת שתי פינצטות קטנות, מנתחים את ההיפוקמפוס תחת סטריאומיקרוסקופ. מעבירים את ההיפוקמפוס לצלחת 35 מ"מ מוכנה (משלב 6.1.2) המכילה MEM.
    הערה: יש לחזור על שלבים 6.3-6.6 עבור כל גור.
  7. חותכים את ההיפוקמפוס לפרוסות של כ-1 מ"מ בעזרת האזמל. הוסף 200 μL של תמיסת טריפסין (מדולל לריכוז סופי של 0.25%). מערבבים בעדינות ודגרים בטמפרטורה של 37°C, 5-10% CO2 למשך 30 דקות.
  8. לאחר הדגירה, להוסיף 2 מ"ל של MEM קר (שלב 6.1.2) לצלחת כדי להשבית את טריפסין. מעבירים את רקמת הטריפסינזציה לצינור 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל יום ראשון בינוני שחומם מראש ל 37 ° C (שלב 6.1.3) באמצעות פיפטת פסטר זכוכית עם הקוטר הגדול ביותר (שלב 6.1.5).
    הערה: היחס הטוב ביותר בין בינוני לרקמה (v:v) לעיבוד נוסף של הרקמה הוא 1 מ"ל/8 היפוקמפי. הימנעו ככל האפשר מהעברת המדיום עם הרקמה.
  9. לשלש את הרקמה על ידי העברתה דרך פיפטת זכוכית בקוטר הגדול ביותר 10-15 פעמים. לאחר מכן, חזור על תהליך זה באמצעות פיפטה זכוכית עם קוטר בינוני. המשך triturating עם פיפטה בקוטר הקטן ביותר. הימנע מבעבוע כדי להפחית מוות תאי.
  10. תנו לחתיכות הרקמה הנותרות לשקוע במשך 2-5 דקות, ואז העבירו את הסופרנאטנט לצינור נוסף של 15 מ"ל. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    הערה: צפיפות התאים העדיפה היא 200,000-400,000 תאים/מ"ל. השתמש במדיום היום הראשון כדי לדלל או בצנטריפוגה ב 470 x גרם כדי לרכז את התאים.
  11. זרעו 100 מיקרוליטר של תאים על כל כיסוי זכוכית. בזמן הזריעה, הקפידו לכסות את כל הכיסוי בתאים. לדגור ב 37 ° C, 5-10% CO2.
  12. למחרת, להוסיף 500 μL של מדיום גידול עצבי לבארות.
    הערה: הרכב מדיום הגידול העצבי מתואר בטבלת החומרים.
  13. העבירו בעדינות כל מכסה לבאר המתאימה לו באמצעות פינצטה תוך הסרת מדיום היום הראשון על ידי הטיית הכיסוי. יש לשאוב את המדיה הנותרת מהמכסה.
  14. לדגור ב 37 ° C, 5-10% CO2. הימנעו מהחלפת המדיום במהלך הדגירה. ניתן לשמור על תרבויות בתנאים אלה עד חודש אחד. החשש העיקרי הוא לחות. לכן, הקפידו לשמור על לח מקסימלי של האינקובטור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להכין את מטריצת שלד האלמוגים, כל שלד האלמוגים (איור 1A) נשבר לשברים של 0.5-2 ס"מ באמצעות פטיש (איור 1B) ונוקה ביסודיות משאריות אורגניות באמצעות שלושה שלבים (שלב 1 בפרוטוקול) באמצעות תמיסת היפוכלוריט 10%, תמיסת NaOH 1M ותמיסת 30%H 2 O2 (איור 1C). שברי אלמוגים נוקו היטב כאשר צבע השלד השתנה מחום (איור 1D) ללבן (איור 1E). לאחר מכן, החתיכות שנוקו (איור 2A) נטחנו באמצעות חומר מליטה ומזיק (איור 2B) או מכונת טחינה חשמלית (איור 2C). שני ההליכים הניבו תוצאות דומות: תערובת של גרגרים שגודלם נע בין 20 מיקרומטר ל-200 מיקרומטר (איור 2D-G).

אחד היתרונות של מטריצה מגורענת על פני מצעים מסיסים הוא שניתן לשנות כמה מתכונותיה המבניות והפיזיקליות, מה שהופך אותה לכמותית יותר. במטריצת גרגרי שלד אלמוגים זו, שתיים מתכונות תערובת הדגנים עברו מניפולציה: גודל הגרגר וצפיפות הגרגרים. כדי לצמצם את מגוון הגדלים של 20 מיקרומטר עד 200 מיקרומטר שנוצר על ידי הליך השחזה לעיל, נבחרה גישת ניפוי באמצעות רשת סינון של 40 מיקרומטר. באמצעות מסננות ידניות (איור 3 A-D) או חשמליות (איור 3E) יוצרו שני סוגים של תערובות דגנים: אחד עם גרגרים בגודל של 40 מיקרומטר עד 200 מיקרומטר (איור 3 F,H) והשני בגודל של 40 מיקרומטר או פחות (איור 3G,I). צפיפות הגרגרים שציפו את הכיסויים והצלחות נקבעה פשוט על-ידי מריחת כמויות משתנות של גרגרים והצמדתם לכיסויים על-ידי חום (איור 4C) או על-ידי צלוחיות וכלים על-ידי כוח הכבידה (איור 4H). בדרך זו נוצרו מטריצות בעלות צפיפות נמוכה (איור 4 D,F,I) וצפיפויות גבוהות (איור 4E,G,J).

איור 5 מדגים את התוצאה של גידול תאי היפוקמפוס על גבי כיסויים המצופים בגרגרי שלד אלמוגים בגודל <40 מיקרומטר (10 מ"ג/מ"ל). מיקרוגרפים של ניגודיות פאזה מראים שהתאים יצרו רשתות עצביות מורכבות בהיעדר (איור 5A) ובנוכחות (איור 5B) של המטריצה. צביעת גרעיני התא (איור 5C,D) הצביעה על כך ש-14 יום לאחר הזריעה, צפיפות התאים הייתה גבוהה יותר על המטריצה מאשר על הכיסויים הלא מצופים. צביעה בחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2) הראתה שרשת עצבית ודנדריטית מורכבת נוצרה על המטריצה (איור 5F) בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 5E). בנוסף, תאי גליה שגדלו על מטריצת שלד האלמוגים שהודמיינו באמצעות חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) עברו שינויים מורפולוגיים משמעותיים. הם רכשו מראה קוצני יותר עם תהליכים ארוכים יותר מאשר תאי גליה שגדלו על מצע הביקורת, שם הם נראו עגולים ושטוחים יותר (איור 5G,H).

Figure 1
איור 1: ניקוי שלד האלמוגים. (A) השלד של האלמוג Stylophora pistillata. (B) שברי שלד מפורקים לפני הניקוי. (C) השברים מ-(B) לאחר טיפול בתמיסת היפוכלוריט, נתרן הידרוקסידי ומי חמצן. (D) הגדלה של מקטע לא נקי המוצג ב-(B). (ה) הגדלה של קטע נקי המוצג ב-(C). קנה מידה: A = 20 מ"מ; B,C = 10 מ"מ; D,E = 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שחיקת שלד האלמוגים. (A) ניקוי שברי שלד אלמוגים. (B) טיט ופשט המשמשים לטחינה ידנית. חץ אדום מצביע על הגרגרים שנוצרו. (ג) מכונת השחזה. חץ אדום מצביע על הגרגרים שנוצרו. (D) דגנים לאחר טחינה ידנית. (ה) גרגרים לאחר טחינה מכנית. (ו) הגדלה של (ד). (ז) הגדלה של (ה). קנה מידה: A = 15 מ"מ; D,E = 3 מ"מ; F,G = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שליטה על גודל הגרגר. (א-ד) הליך מאמץ ידני. (A) שימוש במסננת של 40 מיקרומטר. (B) מסננת עם גרגרי קרקע לא מתוחים שהונחו בצינור של 50 מ"ל ונמתחו באמצעות מערבולת. (C) גרגרי <40 מיקרומטר מתוחים בתחתית הצינור של 50 מ"ל. (D) גרגרים בגודל מינימלי הדומה לזה של הרשת (>40 מיקרומטר, חץ צהוב). (E) מסננת מכנית המשמשת לסינון <40 מיקרומטר גרגרים מתערובת של גרגרים בגודל 20 מיקרומטר עד 200 מיקרומטר. (ו) הדגמה של גדלים שונים של דגנים לאחר טחינה לפני הסינון. (G) הדגמה של גרגרים מתוחים <40 מיקרומטר. (H) הגדלה של (F). (I) הגדלה של (G). קנה מידה: F,G = 900 מיקרומטר; H,I = 300 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שליטה בצפיפות המטריצה. (A) צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם גרגרי <40 מיקרומטר מדוללים ל-10 מ"ג/מ"ל עם DDW לכיסויים, PDL לכלים אחרים. (B) כיסוי זכוכית עם 40 μL של תמיסת 10 מ"ג/מ"ל. (C) כיסויים עם 40 μL של תמיסת 10 מ"ג/מ"ל המתייבשים על פלטה חמה שחוממה מראש ל-80°C, ומאפשרים לגרגרים להיצמד לכיסוי. (D) כיסוי מצופה בריכוז גרגרים של 5 מ"ג/מ"ל לאחר אידוי DDW. (E) כיסוי מצופה בריכוז גרגרים של 10 מ"ג/מ"ל לאחר אידוי DDW. (ו) הגדלה של (ד). (ז) הגדלה של (ה). (H) תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל בצלוחית T-25, 60 מ"מ. (I) בקבוק מצופה בגרגרים בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל. (J) בקבוק מצופה בגרגרים בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל. קנה מידה: B,D,E,I,J = 3 מ"מ; F,G = 600 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: טיפוח תאים עצביים בהיפוקמפוס על מטריצת שלד האלמוגים. תמונות מראות תאים שחולצו מהיפוקמפי של גור חולדות בן 0-3 ימים שגדל בתרבית במשך 14 יום ומוכתמים ב-GFAP (אדום, תאי גלייה), MAP2 (ירוק, סומות עצביות ודנדריטים), DAPI (כחול, גרעיני תאים). (A) תמונת ניגודיות פאזה של תאים בהיעדר המטריצה. (B) תמונת ניגודיות פאזה של תאים שגדלו על מטריצת שלד האלמוגים. (C) תאים שגדלו ללא מטריצה מוכתמת ב-DAPI. (D) תאים שגדלים על מטריצת שלד האלמוגים המוכתמים ב-DAPI. (E) תאים שגדלו בהיעדר מטריצה מוכתמת עבור MAP2. (F) תאים שגדלו על מטריצת שלד האלמוגים המוכתמים עבור MAP2. (G) תאים שגדלו ללא מטריצה מוכתמת עבור GFAP. (H) תאים שגדלו על מטריצת שלד האלמוגים המוכתמים עבור GFAP. (I) תמונה ממוזגת של (C),(E),(G). (J) תמונה ממוזגת של (D),(F),(H). קנה מידה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה המוצגת כאן מתארת דרך לשפר את התחזוקה והפונקציונליות של תאים עצביים בתרבית. הדבר מושג על ידי היצמדות התאים למטריצה העשויה מגרגירי שלד אלמוגים המזינה את התאים ומקדמת את גדילתם ופעילותם. שימוש בטכניקה זו מגדיל את יכולתו של מודל התרבית העצבית לחקות את סביבת התאים במוח.

להכנסת המטריצה כמצע תרבית יש מספר יתרונות על פני מצעים אחרים המשמשים בשיטות קלאסיות של תרבית תאים עצביים. ראשית, הוא מגביר את היצמדות התאים. השילוב של שלד אלמוגים ו-PDL יוצר הדבקה חזקה יותר מאשר זכוכית ו-PDL (לא מוצג). עלייה כזו בהידבקות הוכחה כחיונית להישרדותם של תאים לא צפים דבקים בתרבית32. שנית, גבישי הסידן המוגז של גרגרי שלד האלמוגים הם מקור ליוני סידן שלמעשה נספגים בתאים. סביר מאוד להניח שזו הסיבה לעמידות משופרת ולצפיפות מוגברת (איור 5C,D) של תאים עצביים המוצגים על מטריצת שלד האלמוגים, בהשוואה לרמת ההישרדות שלהם בהיעדרה26.

יתרון שלישי טמון בעובדה שמטריצת שלד האלמוגים היא למעשה לא מישורית, בניגוד לכיסוי הזכוכית. הגרגרים בנויים בתלת-ממד עם ארכיטקטורת פני שטח מורכבת ומעוקלת. תכונות מבניות אלה משתנות כאשר לוקחים בחשבון שהתאים מתמודדים עם אוכלוסיות דגנים במורפולוגיות, ממדים וצפיפויות שונות. חומר תרבית מחוספס ולא מישורי כזה מחקה טוב יותר את הסביבה של התאים in vivo מאשר הכיסוי השטוח הקלאסי. ואכן, הראינו שהחספוס, הגודל והמורפולוגיה של שלד האלמוגים משפיעים על פיזור התא, הישרדותו ופעילותו 8,26,29.

יתר על כן, התצורה התלת-ממדית שמטריצת שלד אלמוגים מספקת לתאים כמיקרו-סביבה שונה במידה רבה ממטריצות ההידרוג'ל הקונבנציונליות המשמשות לגידול תלת-ממדי במבחנה. בעת שימוש בהידרוג'לים, כגון קולגן וחומצה היאלורונית, התאים מוטמעים בתוך ג'ל23. הג'ל דומה למטריצה החוץ תאית מבחינת מילוי החלל, קשיחות ותכונות אחרות, אך בשל צמיגות הג'לים, תרביות אלה דורשות מערכות הזנה מסובכות על מנת לשמור על התאים מוזנים היטב21,22. לעומת זאת, גרגרי התלת-ממד של שלד האלמוגים מאפשרים לתאים לתפוס את פני השטח שלהם, הפתוחים לחלוטין למדיום התרבית. יתר על כן, בניגוד לתרביות הידרוג'ל, התאים על מטריצת שלד האלמוגים מנוטרים בקלות באמצעות מיקרוסקופ פאזה ופלורסנט.

טכניקה זו יש כמה מגבלות. למרות היתרונות שצוינו לעיל, שלד אלמוגים הוא חומר ביולוגי ולא ניתן לייצר אותו אלא לאסוף אותו מאלמוגים מתים, מה שגורם למגבלות באספקת המטריצה, אם כי חלקם זמינים באופן מסחרי. כמו כן, השימוש בשלדים של מיני אלמוגים מרובים עשוי להציג שינויים בתכונות התרבית. מצד שני, העובדה שכל גבישי שלד האלמוגים עשויים מחומר אחד, ארגוניט, ושניתן לשלוט בגודל הגרגרים, מבטלת את רוב המגוון הכימי והמבני בין המטריצות. הגרגרים של כל הביו-חומרים שנבדקו גדולים מספיק כדי לאלץ את התאים לגדול באופן תלת-ממדי. התאים מטפסים על הגרגרים8, גדלים על ידי חיבור לקצות הגבישים33 ועוברים בין גרגרים27. לחלופין, ארגוניט גיאולוגי, העשוי ממשקעים מאובנים וסידן פחמתי סינתטי, זמין מסחרית וניתן להשתמש בו כמטריצה. עם זאת, הוא עשוי להראות היצמדות נמוכה יותר לכיסויי הזכוכית.

לאור השימוש במינים רבים של אלמוגים, חשוב לציין כי מחקרים מסוימים הראו עדויות לביומינרליזציה של אלמוגים, מה שעשוי להוביל לנוכחות של מרבצים אורגניים מגוונים בין גבישי הסידן הפחמתי. לא ניתן להסיר אותם באמצעות תהליך הניקוי המתואר בפרוטוקולזה 33,34. עובדה זו היא בעלת חשיבות מכרעת בעת זיהוי חומר ביולוגי ליישומים ביולוגיים. במקרה של מחקר זה, בוצעו בעבר מספר צעדים על מנת להבטיח הומוגניות רבה ככל האפשר של הפיגומים. ראשית, שלושה סוגים של אלמוגים נבדקו עבור מטריצות: Porites Lutea, Stylophora Pistillata, ו Trachyphyllia Geoffroyi. לא היו שינויים משמעותיים במונחים של גדילה והישרדות של תאים עצביים על שלדי אלמוגים אלה. תוצאה זו עשויה להצביע על כך שמשקעים אורגניים שונים בתוך השלד אינם בעלי השפעה משמעותית במקרה זה. שנית, ספקטרוסקופיה תת-אדומה של טרנספורמציית פורייה של שלד אלמוגים נקי הראתה היעדר שאריות אורגניות29.

ישנם כמה צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול שיש לקחת בחשבון. ראשית, בעת סינון ידני של הגרגרים, מומלץ להחליף את המסננת מעת לעת, שכן המסננות נוטות להיסתם. המסננת החשמלית משתמשת בכוח רב יותר בזמן הניפוי. לכן, הוא לא נוטה לסתום בקלות. שנית, בעת פיזור תערובת גרגרי ה-PDL-אלמוגים על הכלים והכיסויים, חשוב לעתים קרובות לקפט את התערובת כדי למנוע שקיעה של הגרגרים. זה יבטיח פיזור הומוגני של הפתרון. חשוב לשים לב לתהליך החיבור של הגרגרים לכיסויים. טמפרטורות חימום שגויות במהלך חיבור הגרגרים לכיסוי הזכוכית, תנודות וגורמים אחרים עלולים לגרום לגרגרים להתנתק לפני או אחרי זריעת התא. מומלץ לפתור בעיה זו על ידי שליטה קפדנית בטמפרטורה ומזעור הרעידות. כמו כן, עדיף לבצע את הניסויים בשעה קבועה לאחר ציפוי הצלוחיות והצלחות. מומלץ לצפות את הכלים יום לפני התרבית. דגירה ממושכת של מנות עם תערובת הדגנים PDL יכולה לגרום לגיוון בכמות הגרגרים המחוברים למנה.

כמה שינויים של הטכניקה המתוארת לעיל אפשריים על פי הצרכים של תאים בתרבית. בנוסף ליכולתו לשפר את צמיחת התאים העצביים בתרבית, מטריצות שלד האלמוגים תומכות בגדילה של אוסטיאוציטים30,31, הפטוציטים וקרדיומיוציטים (נתונים שלא פורסמו). כדי להגביר את עמידות התרבית של סוגי תאים אחרים, מומלץ לבדוק את התגובה התאית החזקה ביותר לשלדים מסוגי אלמוגים שונים, כמו גם לייעל את גודל וצפיפות הגרגרים.

ניתן גם לגדל תאים עצביים ישירות על הגרגרים, ללא ציפוי נוסף. עם זאת, ציפוי מקדים של הגרגרים עם PDL, כפי שהוזכר בפרוטוקול זה (שלב 5) משפר מאוד את ההידבקות וההישרדות של התאים העצביים, מעל הרמות המתקבלות עם זכוכית מצופה PDL. ניתן גם להשתמש בחומרי ציפוי אחרים בהתאם להעדפה של סוגי תאים שונים.

ראוי להזכיר כי גודל הגרגרים במטריצה מוגבל. מעל סף מסוים, כ -200 מיקרומטר, קשה לקשור אותם לכיסויי הזכוכית. לכן, לחספוס משטח המטריצה יש טווח סופי. ניסויים הדורשים גרגרים גדולים יותר או חתיכות שלד אינם מתאימים לטכניקה זו. אפשר למצוא דרך חלופית לחבר גרגרים גדולים יותר, אולי באמצעות דבקים או ג'לים, אבל זה עלול לטשטש את מגע התא עם הגרגרים. אפשרות נוספת היא לטפח את התאים ישירות על השלד, ללא שחיקה. שיטה זו דורשת שינוי של הליך זריעת התא24,27. המבנה התלת-ממדי של שלד האלמוגים הלא-קרקעי אכן תורם להישרדות תאים עצביים, כפי שדיווחנו לפני26. עם זאת, מטריצה כה מורכבת וצפופה מקשה על עבודת המיקרוסקופ. המבנה הפגום של שלד הקרקע משמר את התכונות הכימיות של השלד, מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה דו-ממדית, ובשל גודלם הגדול של הגרגרים, מאלץ את התאים לגדול בתלת מימד8.

יתר על כן, עודף של גרגרי שלד אלמוגים עלול להיות רעיל. כאמור, מרכיב הסידן במטריצת שלד האלמוגים נספג בתאים35. עודף סידן הנגרם על ידי צפיפות דגנים גבוהה עשוי להיות נטל או אפילו מעכב לסוגי תאים מסוימים, כמו במקרה של תאים עצביים36. לכן, הפחתת צפיפות הגרגרים עשויה להידרש ולהיות מותאמת לכל סוג תא. בנוסף, חשוב לזכור כי זמינות שלד האלמוגים עשויה להיות מוגבלת. אלמוגים גדלים לאט באקווריומים ובסביבתם הטבעית. צמיחתם נעצרת עוד יותר כתוצאה מההתחממות הגלובלית והחמצת האוקיינוסים37. לפיכך, השפע והזמינות של שלדי אלמוגים מוגבלים.

התחזקות התאים העצביים המנותקים במגע עם גרגרי שלד אלמוגים בתרבית פותחת אפיקים חדשים למחקר בנוירוביולוגיה. גדילה תאית, הרחבה עצבית והשלכותיה, כמו גם סינפטוגנזה ופלסטיות סינפטית, ניתן לחקור בעוצמה מוגברת ומשך ניסוי ממושך.

כמו כן, נראה כי מטריצת האלמוגים גורמת לעלייה בחלק מהתפקודים התאיים של תאי הגלייה, כגון גדילה, תגובתיות והתפשטות. לכן ייתכן שתנאים אלה גם מגבירים את היכולת האסטרוציטית להעשיר את מצע התרבית העצבית המנותקת בגורמים טרופיים מופרשים, דבר שעשוי להיות ישים לרפואה רגנרטיבית של מערכת העצבים המרכזית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית KAMIN של משרד המסחר והעבודה הישראלי ועל ידי Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Greiner #60-662160
B-27 Gibco #17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma #A4503
D – glucose Sigma #G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) Sigma #D5796
Electrical sieve Ari Levy #3700
Fetal Bovine Serun (FBS) Biological Industries #04-007-1A
First Day Medium 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks Greiner #60-690160 25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine Sigma #F0503
Glass Coverslips Menzel-Glaser #BNCB00120RA1
H2O2 Romical #007130-72-19 Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture Sigma #N4888
HANK'S solution Sigma #H6648
Kynurenic acid Sigma #K3375
L - glutamine Sigma #G7513
Manual strainer (40µm) VWR #10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM) Sigma #M2279
Mortar and pestle De-Groot 4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite) Sigma #425044 Hazardous
NaOH Sigma #S8045 Hazardous
Neuronal Growth Medium 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish Greiner #60-628160, #60-627160 60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine Sigma #P7280
Smart Dentin Grinder KometaBio #GR101
Trypsin Gibco #15-090-046
Uridine Sigma #U3750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

Tags

Retraction גיליון 160 מדעי המוח הנדסת רקמות תרבית עצבית תרבית עצבית שלד אלמוגים הנדסת תרביות תאים תרבית היפוקמפוס
הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, O. E., Hendler, R. M.,… More

Weiss, O. E., Hendler, R. M., Baranes, D. Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix. J. Vis. Exp. (160), e60443, doi:10.3791/60443 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter