Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Elektromekanisk bedömning av optogenetiskt modulerad kardiomyocytaktivitet

Published: March 5, 2020 doi: 10.3791/60490
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, University Heart Center Freiburg-Bad Krozingen, Medical Center-University of Freiburg, 2Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Vi presenterar ett protokoll för utvärdering av de elektromekaniska effekterna av GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocyter. Vi ger detaljerad information om cellisolering, odling och adenoviral transduktion, och om funktionella experiment med patch-clamp och kolfiber tekniker.

Abstract

Under de senaste två decennierna har optogenetiska verktyg etablerats som potenta medel för att modulera celltyp specifik aktivitet i retliga vävnader, inklusive hjärtat. Medan Channelrhodopsin-2 (ChR2) är ett vanligt verktyg för att depolarisera membranpotentialen i kardiomyocyter (CM), potentiellt framkalla nde potentialer (AP), ett effektivt verktyg för tillförlitlig tysta nde av CM aktivitet har saknats. Det har föreslagits att använda anjon channelrhodopsins (ACR) för optogenetisk hämning. Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma effekterna av att aktivera den naturliga ACR GtACR1 från Guillardia theta i odlade kanin CM. Primära avläsningar är elektrofysiologiska patch-clamp inspelningar och optisk spårning av CM sammandragningar, båda utförs samtidigt tillämpa olika mönster av ljus stimulering. Protokollet omfattar CM isolering från kanin hjärta, sådd och odling av cellerna i upp till 4 dagar, transduktion via adenovirus kodning för ljus-gated klorid kanal, beredning av patch-clamp och kolfiber inställningar, datainsamling och analys. Med hjälp av patch-clamp teknik i hela cellkonfigurationen kan man spela in ljusaktiverade strömmar (i spänning-klämma läge, V-klämma) och AP (nuvarande klämma läge, I-klämma) i realtid. Förutom patch-clamp experiment, utför vi kontraktilitet mätningar för funktionell bedömning av CM aktivitet utan att störa den intracellulära miljön. För att göra detta, celler är mekaniskt förinstallerade med hjälp av kolfibrer och sammandragningar registreras genom att spåra förändringar i sarkomlängd och kolfiber avstånd. Dataanalys omfattar bedömning av AP varaktighet från I-clamp inspelningar, topp strömmar från V-clamp inspelningar och kraft beräkning från kolfiber mätningar. Det beskrivna protokollet kan tillämpas på testning av biofysiska effekter av olika optogenetiska ställdon på CM-aktivitet, en förutsättning för utveckling av en mekanistisk förståelse av optogenetiska experiment i hjärtvävnad och hela hjärtan.

Introduction

ChR-medierade fotoströmmar spelades först in i ögonfläcken av encelliga gröna alger1,2. Strax efter genetisk kloning och heterolog uttryck för Klamydomonas reinhardtii ChR1 och ChR2, ChR användes som verktyg för att ändra membranpotential i Xenopus äggceller och däggdjursceller med ljus3,4. Katjon icke-selektiv ChR depolarisera membranet av celler med en vilande membran potential som är negativ till återföring potential ChR. De kan därmed användas för att framkalla AP i retliga celler, inklusive nervceller och CM, vilket möjliggör optisk pacing5,6.

Komplement till katjon ChR, ljusdriven proton, klorid och natriumpumpar7,8,9 har använts för att hämma neuronal aktivitet10,11,12. Men den senare har begränsningar, kräver höga ljusintensiteter och ihållande belysning, eftersom en jon transporteras per absorberad foton. I 2014, två oberoende studier av Wietek et al. och Berndt et al. beskrev omvandlingen av katjon-genomföra ChR till ACR via mutationer i kanalen por13,14. Ett år senare upptäcktes naturliga ACR i cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som konstruerad ACR visade kvarstående katjonresistans, ersattes de av naturliga ACR, som kännetecknas av en stor enkanalig resistans och hög ljuskänslighet15. GtACR användes för att tysta neuronal aktivitet genom att polarisera membranet potential mot återföring potential klorid16,17. Govorunova et al. appliceras GtACR1 på odlade råtta ventrikulärt CM och visade effektiv fotohämning vid låga ljusintensitetsnivåer som inte var tillräckliga för att aktivera tidigare tillgängliga hämningsverktyg, såsom protonpumpen Arch18. Vår grupp rapporterade nyligen att GtACR1-medierad fotohämning av CM är baserad på avpolbildning och att GtACR1 också kan användas, därför för optisk pacing av CM19.

Här presenterar vi ett protokoll för att studera de elektrofysiologiska och mekaniska effekterna av GtACR1 fotoaktivering på odlade kanin Ventrikulärt CM. Vi beskriver först cellisolering, odling och transduktion. Elektrofysiologiska effekter mäts med hjälp av helcells patch-clamp inspelningar. Ljusmedierade strömmar vid en given membranspänning bedöms i V-klämläge. Membranpotentialdynamikmäts medan cm med elektriskt eller optiskt tempo (I-clamp-läge). Optisk hämning av elektriskt utlöst AP testas med hjälp av ihållande ljusapplicering. Mekaniska effekter mäts med hjälp av kolfibrer i kombination med bildbaserad spårning av sarkomlängd. För att göra detta, optiskt paceable celler är mekaniskt förinstallerade genom att fästa två kolfibrer till plasmamembranet nära motsatta celländar. Sarcomere längdförändringar registreras under optisk eller elektrisk tempo. Slutligen mäts fotohämning under elektrisk fältstimulering av cellerna, och genererade krafter analyseras.

Protokollet innehåller följande steg som visas i flödesschemat i figur 1:kanindjup anestesi, tioöppnaren överdos injektion, hjärta excision, Langendorff-perfusion och vävnad matsmältning, mekanisk dissociation av vävnaden för att frigöra celler, mikroskopisk analys av CM avkastning, odling av CM, transduktion med adenovirus typ 5, följt av inkubation och funktionella experiment.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema för det protokoll som används för att erhålla elektriskt och optiskt tempobart CM. Hjärtan är strukna från kaniner 9-10 veckor gammal, och hjärtvävnad smälts samtidigt som perfunderas med hjälp av en Langendorff setup. Celler frigörs av mekanisk agitation. CM-avkastningen räknas under mikroskop. CM odlas, transduced med adenovirus typ 5 och funktionella experiment utförs 48-72 timmar efter införlivandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla kaninförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som anges i Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och godkändes av de lokala myndigheterna i Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Tyskland).

1. Lösningar för cellisolering

  1. Förbered lösningarna för cellisoleringmed vatten av följande krav(tabell 1)och enligt de joniska kompositioner som anges i tabell 2.
    OBS: CaCl2 och MgCl2 läggs från 1 M lagerlösningar.
Vattenkrav
Konduktivitet [μS/cm] vid 25 °C 0.055
Pyrogen [EU/ml] < 0,001
Partikel (storlek > 0,22 μm) [1/ml] ≤ 1
Totalt organiskt kol [ppb] < 5
Mikroorganismer [CFU/mL] ≤ 1
RNase [ng/mL] < 0,01
DNase [ng/mL] < 4

Tabell 1: Vattenkrav.

Fysiologisk lösning (1) Låg kalciumhalt, hög kaliumlösning (2) Enzymlösning (3) Blockera lösning
NaCl [mM] 137 137 137 137
KCl [mM] 4 14 14 14
HEPES [mM] 10 10 10 10
Kreatin [mM] 10 10 10 10
Taurin [mM] 20 20 20 20
Glukos [mM] 10 10 10 10
MgCl2 [mM] 1 1 1 1
Adenosin [mM] 5 5 5 5
L-karnitin [mM] 2 2 2 2
CaCl2 [mM] 1 - 0.1 0.1
Na-Heparin [IE/L] 5000 - - -
EGTA [mM] - 0.096
Kollagentyp 2, 315 U/mg [g/L] - - 0.6 -
Proteas XIV [g/L] - - 0.03 -
Bovint serumalbumin [%] - - - 0.5
Osmolarity [mOsmol/L] 325 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 345 ± 5

Tabell 2: Lösningar för CM-isolering.

  1. Justera alla lösningar till pH 7.4 vid 37 °C och kontrollera osmolaritet.
    OBS: Lös upp enzymerna (kollagenisk typ 2 och Proteas XIV) direkt före hjärtexcision. Syresätta alla lösningar före användning.

2. Beredning av Langendorff-perfusion-installationen

Obs: Den använda installationen är skräddarsydd. Som avbildas i figur 2består installationen av tre vattenmantade reservoarer (1-3), en spiralmotflödesvärmeväxlare (4) och ett vattenmantat perfusionskärl (5).

Figure 2
Bild 2: Langendorff-perfusion setup optimerad för kanincellisolering. (1-3) Vattenmantade reservoarer med (1) fysiologisk saltlösning, (2) lågt kalcium, hög kaliumlösning och (3) enzyminnehållande kardiopleg lösning. (4) Spiral motflöde värmeväxlare och (5) vatten mantlade uppsamlingstank. Inflödet av det vattenmantade systemet är spiralvärmeväxlaren (temperaturen på lösningar som lämnar perfusionskanylen i slutet av värmeväxlaren bör vara konstant vid 37 °C), följt av perfusionskärlet och de tre reservoarerna. Alla lösningar är syresatta (streckad linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Slå på pumpen av vattenbadet för att cirkulera vatten vid 38 °C i värmeutbytessystemet och värm alla lösningar till 37 °C.
    OBS: Temperaturen vid utflödet av (4) måste styras och konstant vid 37 °C.
  2. Fyll de tre behållarna med respektive lösning och tvätta varje linje (svart) med motsvarande lösning. Fyll huvudlinjen (blå) i slutet utan luftbubblor med hjälp av lösning (1).
    OBS: Syresätta lösningarna före (10 min) och under användning. Fyll linjen från behållaren (3) till kranen med låg kalciumlösning, hög kaliumlösning.
  3. Förbered en sutur för att knyta hjärtat runt aorta vid kanylen.

3. Cellisolering

  1. Förbered följande sprutor.
    1. För sedering/anestesi: Blanda 0,5 ml/kg kroppsvikt esketaminhydroklorid (25 mg/ml) och 0,2 ml/kg kroppsvikt xyllazinehydroklorid (2%).
    2. Fyll två sprutor med 12 ml NaCl-lösning (0,9%).
    3. Förbered 6 ml på 12,5 mg/mL Na-thiopental, upplöst i 0,9% NaCl-lösning.
    4. Fyll 0,2 ml esketaminhydroklorid (25 mg/ml) i en spruta.
    5. Späd 0,2 ml Na-heparin (5 000 IE/ml) i 1 ml på 0,9 % NaCl-lösning (slutkoncentration 1 000 IE/ml).
  2. Söva/söva kaniner (9-10 veckor, Nya Zeeland vit kanin, hona eller hane, ~2 kg) via intramuskulär injektion av esketaminhydroklorid och xylazinhydroklorid (steg 3.1.1).
    OBS: Kaniner behöver minst 10 minuter för att vara helt sövd; exakt varaktighet beror på deras kroppsvikt. Bekräfta anestesi med förlusten av den högra reflexen.
  3. Raka bröstet och öronen där venerna finns.
  4. Sätt i en flexibel kanyl i öronvenen, fixa den med tejp och spola den med 0,9% NaCl-lösning.
  5. Injicera 1 ml Na-heparinlösning intravenöst och spola med 0,9% NaCl-lösning.
  6. Injicera 0,2 ml esketaminhydroklorid, spola igen med 0,9% NaCl-lösning och injicera Na-thiopental tillapné.
    KANin bör inte svara på pedalen tillbakadragande reflex.
  7. Öppna bröstet på vänster sida och ta bort hjärtsäcken.
  8. Starta timern när hjärtat är struket och tvätta hjärtat två gånger i fysiologisk lösning.
    OBS: Använd sax med runda tips för att förhindra oavsiktlig skada på hjärtvävnad.
  9. Kanyla aorta i ett bad med fysiologisk saltlösning och hålla all vävnad i lösning. Slå på Langendorff-perfusionssystemet (fysiologisk lösning (1), hastighet 24 ml/min).
  10. Överför hjärtat till Langendorff-perfusion setup, anslut aorta till perfusate munstycket, och tätt knyta hjärtat med suturen runt aorta till kanylen (< 1 min).
    OBS: Fyll kanylen med fysiologisk lösning, se till att inga luftbubblor kommer in i kanylen under transport från cannulationsplatsen till Langendorff-installationen, anslut bubbelfri.
  11. Perfuse hjärtat tills allt blod tvättas ut (2-3 min).
  12. Växla till låg kalciumlösning, hög kaliumlösning (2). Perfuse i 2 minuter efter att hjärtat har slutat slå och byta till enzymlösning.
  13. Börja återcirkulera enzymlösningen, efter 2 min från matsmältningens början, tillbaka in i reservoaren. Sänk hastigheten till 16 ml/min efter 5 minuters matsmältning.
  14. När vävnaden verkar mjuk (40-50 min matsmältning), skär hjärtat av kanylen och separera den vänstra ventrikeln.
  15. Släpp celler genom mekanisk dissociation (dra försiktigt isär vävnaden med en pipett och en fin pincett för att hålla vävnaden) i blockeringslösning.
  16. Filtrera cellsuspensionen genom ett nät (porstorlek på 1 mm2)och centrifugien i 2 min vid 22 x g (gravitationsacceleration).
  17. Ta bort supernatanten som innehåller icke-myocyter och återsuspendera CM i blockeringslösning.

4. Odling av CM

OBS: Utför följande steg under sterila förhållanden.

  1. Späd Laminin (från Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom källare membran, 1 mg/ml) 1:10 i steril fosfat buffrad saline (utan Ca2 +/Mg2 +) till en slutlig koncentration på 100 μg/mL.
  2. Förbered odlingsmedium i M199-Medium med kosttillskott som anges i tabell 3.
Cellodlingsmedium i M199-Medium
Kreatin [mM] 5
L-karnitinhydroklorid [mM] 2
Taurin [mM] 5
Na-Pyruvat [mM] 1
Insulin (bovin bukspottkörtel) [U/L] 0.25
Cytosin-β-D-arabinofuranoside [mM] 0.01
Gentamycin [mg/mL] 0.05

Tabell 3: Cellodlingsmedium.

  1. Steril filterlösning (0,22 μm) och tillsätt 5% fetalt bovinserum.
  2. För patch-clamp experiment autoklavtäcke ø 16 mm, tjocklek nr 0, täck dem med 100 μg/mL laminin direkt före odling.
  3. För kolfiberexperiment, belägga Petri-skålens yta med poly(2-hydroxyethyl metakrylat) (poly-HEMA, 0,12 g/ml i 95:5 EtOH:H20) och låt den stelna.
    OBS: Celler "fastnar inte" på poly-HEMA belagda Petri-rätter; Detta är avgörande för deras friktionsfria kontraktion i cellmekanikstudier.
  4. Efter åter suspenderade CM har bosatt sig (~ 10-15 min), ta bort supernatant, och sedan åter avbryta CM i odlingsmedium.
  5. Räkna CM med en Neubauer kammare och frö vid en måltäthet på 17.500 celler / ml antingen på lamininbelagda täcke eller i poly-HEMA belagda Petri rätter.
  6. Inkubera celler vid 37 °C, 5% CO2 i 3-4 timmar. Byt ut mediet (37 °C) för täckeseedade celler.
  7. Lägg till adenovirus (typ 5) kodning för GtACR1-eGFP vid en multiplicity av infektion (MOI) av 75 och starta funktionella experiment efter 48 timmar.
    OBS: Efter transduktion hålla cellerna i mörkret. Använd röd belysning när du arbetar med blå eller gröna ljusaktiverade proteiner. Ett kommersiellt tillgängligt adenoviralt leveranssystem (se Materialtabell)används för att klona generna som kodar GtACR1-eGFP i adenoviralvektorn. Insatsen av intresse, här GtACR1-eGFP, är PCR förstärks och sedan kombineras med en adenoviral vektor inklusive en CMV promotor i en IN-Fusion Kloning reaktion. CMV (humancytomegalovirus) promotorn används ofta för att driva överuttryck av transgener i däggdjursceller. eGFP är ett förbättrat grönt fluorescerande protein som härrör från Aequorea victoria med en excitation högst 488 nm och ett utsläpp högst 507 nm. Adenovirus (typ 5) producerades externt vid Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr Michael Schupp.
    VARNING: Adenoviral transduktion kategoriseras som BSL-2 säkerhetsnivå arbete, och lämpliga säkerhetsåtgärder krävs lagligt.

5. Funktionella experiment

OBS: Inspelningar utförs med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop. Filtrera transmissionslampan med ett rött bandpassfilter (630/20 nm) i kondensorn för att undvika samtidig aktivering av GtACR1.

  1. Patch-klämma setup
    1. Använd en förstärkare i kombination med en analog till digital omvandlare. Använd ett dataanskaffningsprogram för att registrera aktuella data och spänningsdata (se Tabell över material).
      DE inspelade uppgifterna digitaliseras vid 10 kHz och filtreras vid 5 kHz.
  2. Kolfiber setup
    1. Använd en kamera för att upptäcka kolfiber position och sarcomere längd genom att spåra förändringar i optisk kontrast (kolfibrer visas som mörkare strukturer, överlagrad på striated cellmönster). En schematisk representation av installationen visas i figur 3.
      OBS: Sarcomere längd beräknas i realtid med hjälp av en snabb Fourier omvandla (FFT) av effektspektrumet av strimmermönster.

Figure 3
Figur 3: Schema som visar experimentell inställning för kolfibermätningar. (Ritningen är inte i skala). Två kolfibrer är fästa på en cell och deras position styrs av en piezo positionerare. Pacer används för elektrisk fältstimulering. Lysdioder med flera färger kopplas till epifluorescensporten för det inverterade mikroskopet för belysning av celler i objektplanet. LED-effekten styrs via en särskild kontrollbox, som tar emot digitala pulser via digital utmatning av den digitala analog-omvandlaren (DAC). DAC kommunicerar via analog utgång med fluorescenssystemets gränssnitt. En svartvit kamera (774 pixlar med 245 linjer) för cellulära avbildning är ansluten till datorn för att spåra sarkomlängd och kolfiberböjning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Tidstidsbesatt belysning
    1. Ge ljus för fluorescensmikroskopi och aktivering av ljusgated jonkanaler via en extern specialbyggd LED-kontrollbox, bestående av tre lysdioder av olika färg (460 nm, 525 nm, 640 nm, se Tabell av material).
    2. Ändra microcontroller- och grafiska användargränssnittskoden (GUI) för kontrollboxen så att led-lampan kan kontrolleras via externa TTL-pulser (Time to Live), som genereras i dataförvärvsprogramprotokoll (se Tabell över material). Överför TTL-pulser till LED-styrenheten via den digitala analoga omvandlaren.
    3. Kör led och välj antalet pulser via GRÄNSSNITTET. När du tar emot kommandot från GUI startar mikrokontrolleren en process på en ny kärna. I den här processen kontrolleras TTL-indata samt en kontrollomkopplare från det grafiska gränssnittet kontinuerligt.
    4. När TTL-ingången är positiv slår mikrokontrollerlampan på och fortsätter sedan att kontrollera TTL-ingången. När TTL-signalen återgår till noll stänger mikrokontrollern av lysdioden och minskar antalet pulser som lämnas efter en. Om kontrollomkopplaren vid något tillfälle är falsk eller antalet pulser är noll, stoppar mikrokontrollerprocessen den här processen tills ett nytt kommando tas emot från gränssnittet.
    5. Koppla direkt lysdioderna in i mikroskopets bakport.
  2. Bestämning av ljusintensitet i objektplanet
    1. Mät det belysta området med en stegmikrometer (objektiv förstoring 40x, A = 0,8 mm2).
    2. Använd en optisk effektmätare (se Materialtabell).
    3. Definiera inställningarna för experimenten: excitationvåglängd (525 nm), objektiv förstoring (40x), excitationsfilter (530/20 nm) eller spegel, och läs upp ljuseffekten [W] vid olika LED-ingångsspänningar.
    4. Beräkna ljusintensiteten [W/mm2] genom att dividera ljuseffekten [W] med det belysta området [mm2] (här: 0,8 mm2).
      OBS: Mät den faktiska ljuseffekten med respektive protokoll i steg 5.6 för att kontrollera om korta ljuspulsvaraktigheter på 10 ms räckvidd och långa varaktigheter håller det inställda värdet(tilläggsfigur 1).
  3. Förberedelse för plåstret-klämma experiment
    1. Förbered följande externa och interna lösningar(tabell 4; för vattenkrav se tabell 1).
    2. Justera osmolariteten med glukos till 300 ± 5 mOsmol/L. Aliquot den interna lösningen och förvara vid -20 °C.
      OBS: Håll den interna lösningen på is en dag för inspelningen. Förvara den externa lösningen i rumstemperatur. De här beskrivna patch-clamp lösningar baserades på tidigare använda lösningar och Cl- koncentrationen ändrades till lägre, mer fysiologiska nivåer7. För karakterisering av jonselektivitet en respektive optogenetiska ställdon föreslår vi att variera koncentrationerna av större joner (t.ex. Cl-, Na+, K+, H+) i extra- och intracellulära lösningar19.
    3. Ta av inspelningselektroden från pipetthållaren och ta bort silverkloridskiktet från silvertråden med mycket fint sandpapper.
      OBS: Gör det här steget i början av varje mätdag.
    4. Anslut kabeln till den positiva polen på ett 1,5 V-batteri och sänk ned i 3 M KCl-lösning för silverkloridbeläggning i 10 min.
      OBS: Den negativa polen är ansluten till en referens silvertråd nedsänkt i 3 M KCl-lösningen.
    5. Förbered mätkammaren: lägg silikonfett på mätkammarens ram och placera ett täcksliden (diameter: 50 mm, tjocklek nr 0) på ramens överkant som kammaren är förseglad.
    6. Sätt en referens silver / silver-klorid pellet elektrod i badet och anslut den med huvudet scenen.
    7. Dra 1,7 - 2,5 MΩ patchkärnor från sodalimeglaskapillärer (ytterdiameter: 1,55 mm, innerdiameter: 1,15 mm) med en mikropipettavdragare (se materialtabell).
    8. Starta datainsamlingsprogramvara och justera membrantestet (puls 10 mV för 15 ms, baslinje 0 mV).
Extern badlösning Intern pipettlösning
NaCl [mM] 140 -
KCl [mM] 5.4 11
CaCl2 [mM] 1 -
MgCl2 [mM] 2 2
Glukos [mM] 10 -
HEPES [mM] 10 10
K-Aspartate [mM] - 119
Mg-ATP [mM] - 3
EGTA [mM] - 10
Ph 7.4 (NaOH) 7.2 (KOH)
Osmolarity (justera med Glukos) [mOsmol/L] 300 ± 5 300 ± 5

Tabell 4: Patch-clamp lösningar.

  1. Protokoll för patch-clamp mätningar
    1. Spela in fotoaktiveringsprotokoll i V-klämläget med en hållpotential på -74 mV. Använd ljuspulser på 300 ms.
      OBS: Vi föreslår att utföra V-klämma inspelningar nära vilande membran potential odlade CM (etablerad i I-clamp; i våra händer mellan -79 mV och -77 mV både för transduced och icke-transduced CM19). Nyligen isolerade celler visar en genomsnittlig vilomembranpotential på -79 mV (Kompletterande figur 2, alla värden efter korrigering för flytande korsning potential).
    2. Spela in AP i I-clamp-läge vid 0 pA.
      1. För elektrisk tappning, injicera strömpulser på 10 ms (ramp från 0 pA till det inställda värdet inom 10 ms), 0,25 Hz och hitta tröskeln för att framkalla AP. Spela in AP genom aktuella injektioner på 50% mer än tröskelvärdet.
      2. För optisk pacing använd ljuspulser på 10 ms, 0,25 Hz vid minimal ljusintensitet för att framkalla tillförlitlig AP.
    3. Spela in fotohämning i I-clamp-läge vid 0 pA. Elicit AP enligt beskrivningen i steg 5.6.2.1 och applicera ihållande ljus för 64 s vid 4 mW/mm2 efter 15 elektriskt utlöst AP.
      BILD 6F visar ett fotohämningsprotokoll där högre aktuella injektioner tillämpas under ihållande ljus. Start från 1.5 tider gå i tid (här: 0.7 nA) ökades den injicerade strömmen i kliver av 0.1 nA (finalnivå: 2.2 nA). Vid alla testade strömamplituder hämmade ihållande ljusapplicering AP-generering.
      1. Som ett kontrollexperiment, pausa elektrisk stimulering för 64 s utan lätt applicering.
  2. Patch-klämma experiment
    OBS: Utför följande experiment i mörker (rött ljus kan användas för blå/gröna ljusaktiverade verktyg).
    1. Placera täckglidning med celler i mätkammare med extern lösning och välj fluorescerande CM.
      OBS: eGFP-positiva celler kan detekteras med en blå LED (460 nm) i kombination med ett plåsterexcitationsfilter (450 nm - 490 nm), en 510 nm dichroic spegel och ett 515 nm långpassutsläppsfilter. Om andra lysrörstaggar används använder du motsvarande LED- och fluorescensfilteruppsättningar. Om en hög transduktionseffektivitet uppnås (i våra händer >99% med GtACR1 adenovirus), finns det ingen anledning att kontrollera eGFP-fluorescensen före de funktionella experimenten; detta undviker potentiella GtACR1 pre-aktivering.
    2. Fyll plåstret pipetten med intern lösning. Se till att det inte finns några luftbubblor i spetsen.
    3. Fäst pipetten på pipetthållaren och sätt in den inskjutande silverkloridbelagda silvertråden i den interna lösningen.
    4. När du har nått den cellanslutna konfigurationen växlar du till helcellsläge i dataanskaffningsprogrammet med en innehavspotential på -74 mV. Brista membranet genom att försiktigt applicera undertryck för att komma åt hela cellkonfigurationen. Detta indikeras av en omedelbar ökning av den uppmätta kapacitansen.
    5. Kör de protokoll som beskrivs i avsnitt 5.6.
  3. Kolfiberteknik
    1. Producera kolfibrer.
      1. Använd glaskapillärer med följande parametrar: ytterdiameter: 2,0 mm, innerdiameter: 1,16 mm, längd: 100 mm (se materialtabell). Dra in glaskapillärnen med en mikropipette-avdragare till två pipetter av samma längd (total konalängd ~11 mm, figur 5) till en slutlig innerdiameter på ~30 μm.
        OBS: Inställningar som används för första och andra dragningen är 85,2% (proportion till den maximala utgången av avdragaren) och 49,0%, respektive (beror på glödtrådens avdragare, typ och ålder).
      2. Böj pipetterna upp till 45° med en självgjord mikrosmedja med inställningar på 12 V, 24 A (se bild 4 för information om pipettböjningsupplägget).
        1. Rikta in kapillären (2) på den röda linjen i orienteringscirkeln (5), håll placeringen av kapillärkonstanten så att böjdelens längd alltid är densamma efter orienteringscirkelns mitt (radie på 4,5 mm).
        2. Böj kapillären upp till 45° (grön linje) genom att trycka ner kapillärspetsen med bender (3) och smida genom att värma upp glödtråden (4) tills kapillären fångar 45° vinkel även efter att bender har tagits bort.
      3. Montera kolfibrerna (från prof. Jean-Yves Le Guennec) i den fina spetsen av glaskapillären under ett stereomikroskop. Använd fina pincett med mjuka slangar i slutet för att öka greppet och minska risken för att skada fibrerna.
        OBS: Dessa fibrer kännetecknas av mikrostrukturer, som ökar kontaktytan mellan fibrer och celler, vilket förbättrar vidhäftning20.
      4. Skär kolfibrerna på en längd av 2 mm och använd superlim (cyanoakrylat) för att fixa fibern till den främre delen av kapillären.
        OBS: Ju längre fibrerna är, desto mer böjer de sig vid tillämpning av samma kraft.
    2. Kalibrera kolfibrer.
      1. Kalibrera kolfibrerna med hjälp av en kraftgivare med en känslighet på 0,05 mN/V och ett kraftområde på 0 - 0,5 mN (se materialtabell).
        Obs: Den här inställningen är skräddarsydd för att mäta komprimering istället för "pull".
      2. Fäst kapillären med kolfibern på en hållare som styrs av en mikromanipulator och en piezomotor.
      3. Placera fiberspetsen i kontakt med kraftsensorn, men utan att producera någon kraft och flytta piezomotorn i steg om 10 μm (total rörelse på 60 μm) mot sensorn och läs upp den uppmätta spänningen (E) i Volt.
        OBS: Se till att kraftgivaren kontaktas av själva spetsen av den fria änden av kolfibern.
      4. Upprepa dessa mätningar tre gånger.
      5. Använd formel 1 för att beräkna kraften för varje piezoposition(ΔΕ-skillnaden mellan uppmätt spänning mellan piezomotorstegen):

        OBS: Kraftgivarens känslighet är beroende av givarens modell (här: 0,05 mN/V = 50 μN/V). Förstärkningen kan ställas in på handkontrollen.
      6. Rita kraften [μN] mot piezoläget. Lutningen motsvarar fiberstelheten [μN/μm].
    3. Rekordkraft för upphandlande CM.
      OBS: Utför följande experiment i mörker (rött ljus kan användas för blå/ gröna ljusaktiverade verktyg).
      1. Täck mätkammarens yta med poly-HEMA. Fyll mätkammaren med extern badlösning och lägg några droppar av den odlade cellfjädringen i kammaren (steg 4.9).
      2. Fäst kapillärer med kolfibrer på scenen mikromanipulator. Välj GtACR1-uttryckcm genom att kontrollera möjligheten att inducera sammandragningar genom tillämpning av korta grönt ljus pulser. Rikta in kolfibrerna nästan horisontellt till mätkammarens yta.
      3. Sänk den första fibern på cellytan. Fäst den andra fibern parallellt med den första fibern i andra änden av CM. Den idealiska justeringen är nära vinkelrät mot cellaxeln.
        OBS: Fäst fibern genom att försiktigt trycka cellen på bottenytan. Släpp trycket innan du fäster den andra fibern. Sträck inte cellen genom att fästa den andra fibern.
      4. När båda fibrerna är fästa på cellen, lyft fibrerna, så cellen har ingen kontakt med kammarens yta längre och kan kontrakt utan friktion.
      5. Fokusera sarcomeres i datainsamlingsprogramvaran (se Tabell över material)och ställ in fönstret för sarkomlängdsspårning (Figur 7AI (3)) mellan fibrerna.
        OBS: Resulterande FFT effektspektrum (Figur 7AI (2)) visar helst en skarp topp, som representerar den genomsnittliga sarcomere längd.
      6. Spåra fiberböjning med hjälp av kantdetekteringsmodulen. Ställ in detektionsområdena med det röda och gröna fönstret och definiera ett tröskelvärde (röd och grön horisontell linje) vid det första derivatet av ljusintensitetsspårningen (figur 7A III).
      7. Börja optiskt takt cellen på 0,25 Hz (om möjligt, prova snabbare tempo) och spåra sarcomere längd och fiber böjning.
        OBS: Fiberhållareposition, LED-avtryckare och elektriska stimuleringspulser styrs via datainsamlingsprogramvaran (se Materialtabell).
      8. Efter inspelning av minst 15 optiskt framkallade sammandragningar, fältstimulera cellen elektriskt (se Tabell av material). Hitta tröskeln för att framkalla sammandragningar och spela in genom att tillämpa 1,5 gånger av tröskelspänningen.
      9. För hämningsprotokollet, applicera elektriska stimuli för att framkalla sammandragningar och exponera sedan för ihållande ljus på 64 s (vid olika ljusintensiteter).

Figure 4
Bild 4: Pipettböjningsinställning. (1) Mikromanipulatorn på vänster sida används för att styra kapillärens position och en andra mikromanipulator till höger används för att böja den. (2) Kapillär. (3) Bender. (4) Mikroforge. (5) Orienteringscirkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Pipett e med kolfiber. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Dataanalys

  1. Patch-klämma inspelningar
    OBS: Korrigera alla inspelade och kommandospänningar för vätskekorsningen sett till risken efter experimentet. Bestäm vätskekorsningspotential i dataanskaffningsprogramvaran med hjälp av den potentiella räknaren för verktygskorsningen (för de angivna patch-clamp-lösningarna i tabell 4:14,4 mV vid 21 °C). Subtrahera vätskekorsningens potential från den inspelade/kommandospänningen.
    1. För I-clamp AP inspelningar, kontrollera elektrisk tempo kontra optiskt tempo. Beräkna AP-varaktigheten (APD) vid 20 och 90 % repolarisering med ett specialskrivet skript (Supplemental Material). Bestäm vilande membranpotential och AP-amplitud.
      OBS: Bestäm APD enligt beskrivningen i Wang K. et al.21 Skriptet för att ladda .abf filer är allmänt tillgänglig via följande länk: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Genomsnittliga APD-värden för minst 6 AP.
    2. Kontrollera om originalplanen är 0 pA för V-clamp fotoaktivering. Om inte justera originalplan till noll. Analysera den inspelade strömmen som utlöses av 300 ms ljuspulser vid -74 mV. Överför data till dataanalysprogramvara och bestäm topp- och medelvärdet stationär ström.
  2. Kolfiberexperiment
    1. Kontraktionsinspelningar under optisk pacing: Ladda de inspelade datan i datainsamlingsprogramvaran och läs upp kolfiberns baslinje och maxima och sarkomlängdsförändringar.
      OBS: Medelvärden för 10 sammandragningar av en stabil registrering.
    2. Mät cellbredden och beräkna cellens tvärsnittsområde förutsatt att ett elliptisk tvärsnitt (figur 7B II).
      OBS: Formeln för området för en ellips är A = π·a·b (Formel 2) där a är avståndet från centrum till hörnet och b är avståndet från centrum till co-vertex. I vårt fall innebär detta en = (cellens bredd)/2 och b = (cellens tjocklek)/2. Enligt Nishimura et al.22 kan tjockleken på CM uppskattas vara en tredjedel av cellbredden så att A = π· (1/2)·bredd· (1/2)·tjocklek = π· (1/4)·bredd· (1/3)·bredd = π· (1/12)·bredd2.
    3. Beräkna slutet-systoliskt kraft (F):
    4. Beräkna den slutsystoliska celldeformationen (ESD):

      OBS: Ytterligare kontraktila parametrar kan analyseras: vila sarcomere längd, tid till topp, tid till 90% avkoppling, fraktionerad sarkom förkortning, maximal hastighet av kontraktion och avkoppling (se programvara förvärv manual).

Representative Results

GtACR1-eGFP uttrycktes i odlad kanin CM(figur 6 infoga) och fotoströmmar mättes med patch-clamp teknik. Photoactivation av GtACR1 visar stora inåtriktade strömmar på -74 mV. I figur 6En toppström(IP)vid 4 mW/mm2 är 245 pA. AP utlöstes antingen elektriskt (figur 6B) eller optiskt(figur 6C)med aktuella injektioner 1,5 gånger tröskeln, eller korta depolariserande ljuspulser på 10 ms, respektive. Analysera APD-värden, elektriskt tempo CM visar en APD 20 av 0,24 ± 0,08 s och en APD 90 av 0,75 ± 0,17 s, Optiskt tempo CM visar en APD 20 av 0,31 ± 0,08 s och en APD 90 av 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, i det här presenterade exemplet APD 20elektrisk = 0,17 s. APD 20optisk = 0,27 s och APD 90elektrisk = 0,61 s; APD 90optisk = 0,68 s; Figur 6D). Optiskt tempo CM visar en långsammare AP-debut (bild 6D). CM aktivering hämmades vid ihållande belysning (för 64 s, 4 mW/mm2)genom att polarisera membranpotentialen mot återföringspotentialen hos klorid, här -58 mV (figur 6E). Högre ströminjektioner än 1,5 gånger tröskelvärdet framkallar inte AP-generering (figur 6F). Genererade toppkrafter bestämdes från kolfiberböjning (figur 7B,C,E). CM genererade 232 μN/mm2 vid elektrisk tappning(figur 7B)och 261 μN/mm2 efter optisk tappning (figur 7C). Förlängda grönljuspulser hämmar sammandragningar (figur 7E). Efter optisk hämning för 64 s, återkommande sammandragningar generera en lägre kontraktil kraft, och kraftvärden återhämta sig mot baslinjen efter ~ 10 sammandragningar (pacing på 0,25 Hz, figur 7D) i linje med diastolisk kalciumförlust från kanin CM.

Figure 6
Figur 6: Representativa patch-clamp inspelningar av elektriskt och optiskt tempo /hämmad CM. (A)Representativ fotoström vid -74 mV med en ljuspuls på 300 ms, 4 mW/mm2. IP anger toppströmmen. Insatsen visar en gtACR1-eGFP-positiv cell. (B)Representativ AP-inspelning vid 0 pA med en strömramp på 10 ms, 0,6 nA för att elektriskt snabba CM.(C)Representativ AP-inspelning vid 0 pA med ljuspulser på 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D)Toppdiagrammet visar överlagringen av den10:e AP:n för elektriskt (blått) och optiskt (grönt) aktiverat CM. AP justerades av den maximala förändringen i membranpotentialen (dV/dt max). Bottengraf visar skillnaden mellan membranpotential mellan optiskt och elektriskt utlöst AP (Eoptisk-Eelektrisk). (E)Elektriskt utlöst AP hämmades under ihållande ljus av 64 s, 4 mW/mm2. (F)AP hämmas av högre ströminjektioner än 1,5 gånger tröskeln (från 0,7 nA i steg 0,1 nA till 2,2 nA) under ihållande ljus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Representativa data från kolfiberinspelningar av optiskt och elektriskt tempo/hämmad CM. (A)Display i datainsamlingsprogrammet. Bild (I) visar den uppmätta CM med fönstret för beräkning av sarkomlängd. Cellbredden är märkt med orange. (1) Intervall för relevanta frekvenser. (2) FFT effektspektrum visar frekvensen av sarcomere avståndet på cellen. Den genomsnittliga sarkomrelängden beräknas utifrån toppfrekvensen. (3) Sarcomere längd spårningsfönster. (4) Spårstyrka. (5) Intensitetsspårningen multiplicerad med ett Hamming-fönster är den fönsteriga intensitetsspårningen. Schema (II) visar cellens elliptiska tvärsnitt. Bredd i orange och tjocklek i streckad blå. Bild (III) visar kolfibrernas position med respektive detektionsboxar, som lämnas i rött och höger i grönt. (6) Spårstyrka. (7) Första derivatet av intensitetsspårning (se handbok för programvara för datainsamling). (B)Representativa spår av elektriskt framkallade sammandragningar. Panel (I) visar sarkomlängd sförkortning, panel (II) avståndet mellan de två kolfibrerna. C)Representativa spår av optiskt framkallade sammandragningar (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) visar sarkomlängd sförkortning, panel (II) avståndet mellan de två kolfibrerna. (D)Genererade toppkraft från kontraktion 1 till 11 efter en paus orsakad av hämning av AP-generering. (E)Representativa spår av optisk hämning av sammandragningar under ihållande belysning (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) visar sarkomlängd förkortning, panel (II) längden mellan de två kolfibrerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

A Området
Acr anion channelrhodopsin
Ap handlingpotential
Apd åtgärden potentiell varaktighet
Cfu kolonibildande enhet
Chr channelrhodopsin
Cm kardiomyocyte
eGFP förbättrat grönt fluorescerande protein
Esd avsluta systoliskt celldeformation
Eu endotoxinenheter
F Kraft
Fft snabb Fourier omvandla
GtACR (gtacr) Guillardia theta anjon channelrhodopsin
Gui grafiskt användargränssnitt
I-klämma strömklämma
Ie internationella enheter
Moi mångfald av infektion
poly-HEMA poly(2-hydroxyethyl metakrylat)
V-klämma spänningsklämma

Tabell 5: Lista över förkortningar.

Supplemental Figure 1
Kompletterande figur 1: Ljusintensitetsmätningar med optisk effektmätare. (A)Mätning av 10 ms ljuspulser vid 4 mW/mm2. (B)Mätning av ihållande belysning på 64 s vid 4 mW/mm2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 2
Kompletterande figur 2: Egenskaper hos nyisolerade CM och deras strukturella anpassning i kulturen. A)AP-registrering av en nyisolerad CM (APD 20 av 1,11 ± 0,34 s, APD 90 av 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Genomsnittlig vilomembranpotential på -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B)Kolfiberinspelning av en elektriskt stegad nyisolerad CM. Genomsnittlig toppkraft på 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). C)Konfokalbilder av en nyisolerad CM (I). untransduced (II) och transduced (III) CM efter 48 timmar i kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande material: MatLab skript för att bestämma APD och vilande membran potential. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Optogenetiska verktyg möjliggör modulering av retlig cellelektrofysiologi på ett icke-invasivt sätt, men de behöver grundlig karakterisering i olika celltyper (t.ex. CM) för att man ska kunna välja det bästa tillgängliga verktyget för en specifik experimentell design. Patch-clamp-tekniken är en standardmetod för bedömning av cellulär elektrofysiologi. I hela cellkonfigurationen tillåter det en att spela in fotoaktiverade strömmar över plasmamembranet eller tidsmässiga förändringar i membranspänningen efter ljusstimulering/hämning. Optogenetisk manipulation av elektrisk excitation påverkar också CM sammandragningar. Vi använder sarkom spårning och kolfiber-assisterad kraft mätningar för att kvantifiera effekterna av optiska förhör på den mekaniska aktiviteten hos myocyter.

Vi beskriver ett protokoll för att karakterisera de grundläggande effekterna av en ljusgrindd kloridkanal, GtACR1, i CM. Som modellsystem valde vi kanin CM, eftersom deras elektrofysiologiska egenskaper (t.ex. AP-form och eldfast period) liknar de som observerats i mänskliga CM närmare än gnagare CM. Dessutom kankanin CM odlas i flera dagar, tillräckligt länge för adenoviral leverans och uttryck för GtACR1-eGFP. Särskilt isolerade CM ändra sina strukturella egenskaper i kulturen över tiden, inklusive avrundning av celländar och gradvis förlust av kors-strimmig, T-rörformiga system och caveolae23,24. I linje med detta har funktionella förändringar rapporterats i odlade CM: depolarisering av vilande membran potential, förlängning av AP och förändringar i cellulära Ca2 + hantering. För granskning av cellulära anpassningar i kultur, se Louch et al.25. Kompletterande figur 2 visar exemplariska AP och kontraktion mätningar av nyisolerade CM för jämförelse med dem som observerats i odlade CM(figur 6, figur 7) med hjälp av här presenterade protokollet.

Helcellsbandklämning möjliggör direkta mätningar av fotoströmsegenskaper (t.ex. amplituder och kinetik) och ljusinducerade förändringar i membranpotential eller AP-egenskaper vid hög tidsmässig upplösning. Sådana inspelningar har dock flera begränsningar: För det första ersätts cytosolet av pipettlösningen i helcellinspelningar, vilket är fördelaktigt att kontrollera joniska elektrokemiska gradienter, men har den inneboende nackdelen med att tvätta cellulära organeller, proteiner och andra föreningar, vilket kan påverka cellulära elektriska reaktioner. För det andra, biverkningar som aktivering av ytterligare jonkanaler till följd av icke-fysiologiskt lång depolarisering (t.ex. långsam tid konstanter av ljus-gated jonkanaler) är svåra att bedöma eftersom vår metod endast tillåter en att upptäcka förändringar i APD, men inte att genomföra direkta mätningar av joniska koncentrationer i elektrofysiologiskt relevanta cellfack. Detta kan göras med lysrörsindikatorer (t.ex. Ca2+ sensorer) eller jonselektiva elektroder. Ytterligare karakterisering kan omfatta ljusintensitetstitreringar, bestämning av pH-beroende, fotoströmskinetik vid olika membranpotentialer och återvinningskinetik under repetitiv ljusstimulering.

I motsats till patch-clamp inspelningar, encellig kraft mätningar möjliggör analys av cellulära sammandragningar av intakta myocyter utan att påverka deras intracellulära miljö. Sekundära effekter på jonkoncentrationer (t.ex. ca2+) kan indirekt bedömas genom att fastställa genererad kraftamplitud och dynamik (t.ex. maximal hastighet för kontraktion och avslappning; här inte analyseras). Kraftmätningar med kolfibertekniken har en fördel jämfört med fritt upphandlande celler eftersom de ger direkt information om passiva och aktiva krafter i förinstallerade celler (dvs. under förhållanden som är mer lika in situ- eller in vivo-inställningarna). Mekanisk förlastning är särskilt viktigt vid analys av cellulär kontraktilitet, eftersom stretch påverkar kraftproduktion och avkoppling26,27.

Optogenetiska metoder möjliggör spatiotemporally exakt manipulation av cellulärmembran potential, både i enstaka CM och intakt hjärtvävnad. Klassiskt har ChR2, en ljusgrindd katjon som inte selektiv kanal, använts för depolarisering av membranpotentialen, medan ljusdrivna proton- och/eller kloridpumpar användes för membranhyperpolarisering. Båda grupperna av optogenetiska ställdon kräver höga uttrycksnivåer, eftersom ChR2 kännetecknas av en egenlåg enkanalig ledningsförmåga28 och ljusdrivna pumpar transporterar maximalt en jon per absorberad foton. Dessutom kan långvarig aktivering av ChR2 i CM leda till Na+ och /eller Ca2 + överbelastning, och ljusdrivna pumpar kan ändra trans-sarcolemmal H+ eller Cl- lutningar29,30. I sökandet efter alternativa verktyg för optogenetisk kontroll av CM-aktivitet testade vi nyligen den naturliga anjonkanalenrhodopsin GtACR1, som kännetecknas av en överlägsen enkanalig konduktion och högre ljuskänslighet jämfört med katjonChR som ChR2. Vi fann att GtACR1 aktivering depolariserar CM och kan användas för optisk pacing och hämning, beroende på ljuspuls timing och varaktighet. En ytterligare fördel med att använda ACR istället för katjon ChR kan vara den mer negativa återföringspotentialen hos Cl- jämfört med Na+, vilket minskar artificiellt introducerade jonströmmar. Som vi tidigare har visat kan optisk pacing med GtACR1 leda till AP förlängning som ett resultat av den långsamma komponenten i GtACR1 kanal stängning, som kan övervinnas genom att använda snabbare GtACR1 mutanter19. Ap-förlängningen är dock mycket mindre uttalad när du använder en lägre, mer fysiologisk intracellulära Cl- koncentration (se figur 6). Dessutom resulterar GtACR1-medierad hämning av långvarig belysning i djupgående membrandepolarisering, som återigen kunde aktivera sekundära Na+ och Ca2 + tillströmning, vilket ändrar aktiviteten hos spänningsgated kanaler. I våra mätningar finner vi att AP- och kontraktionparametrar återhämtar sig till baslinjen inom 40 s efter en ljusinducerad hämning i 1 min (se Kopton et al. 2018, figur 6, figur 7). Ljusgated K+ kanaler erbjuder ett kraftfullt alternativ för att tysta CM utan att påverka CM vilomembran potential31.

I framtiden vill vi kvantitativt jämföra olika optogenetiska verktyg för deras potential att hämma hjärtaktivitet. För detta ändamål testar vi en mängd ljus-gated jonkanaler inklusive ACR, ChR2 och rödskiftade ChR varianter32, samt hyperpolariserande ställdon såsom halorhodopsin eller ljuset gated adenylyl cyklas bPAC i kombination med kaliumkanalen SthK (PAC-K)31.

Det här presenterade protokollet kan användas för djupgående karakterisering av CM:s elektromekaniska egenskaper. Det är huvudsakligen tillämpligt även på CM från andra arter, och cm isolerat från sjuka hjärtmuskeln. Optisk stimulering gör det möjligt för en att takten CM vid olika frekvenser, och olika förladdningar kan testas under kolfiber kontraktion experiment. Ett intressant experiment skulle vara att använda lågintensiv belysning för subthreshold depolarization, för att efterlikna gradvis ökning av vilomembranet potential, som kan observeras under utvecklingen av hjärtvävnad remodeling under sjukdomsprogression. Slutligen, funktionella mätningar kan kombineras med Ca2 + imaging för ytterligare insikt i excitation-kontraktion koppling, eller med farmakologiska insatser för att utvärdera effekterna av olika läkemedel på CM aktivitet.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Stefanie Perez-Feliz för utmärkt tekniskt bistånd, Dr Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) för att tillhandahålla pUC57-GtACR1 plasmid, professor Dr Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) för adenovirus produktion och Dr Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) för att dela sin expertis för att förbättra cellisoleringsprotokollet och att omforma pipette bending setuping. Projektet finansierades av Tyska forskningsstiftelsen (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noeter gemenskap: SCHN1486/2-1) och ERC Advanced Grant CardioNECT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
Aortic cannula Radnoti 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0151 Borosilicate Glass
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm Samuel Findings, London, UK TSGBL3
Incubator New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland Galaxy 170S
Langendorff-perfusion set-up Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany Custom-made
Langendorff-pump Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland ISM444
Mesh: Nylon Monodur filter cloth Cadisch Precision Meshes Ltd 800 µm holes, 1 m wide
Neubauer chamber VWR International GmbH, Leuven, Belgium 717806
Rabbit, New Zealand White Charles River Strain Code: 052
Scissors Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BC774R Bauchdeckenschere ger. 18cm
Sterile filter, 0.22 µm Merck, Darmstadt, Germany SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier AxonInstruments, Union City, CA, United States Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0178 Borosilicate Glass
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, San José, CA, United States 1550A
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878 BZ:00
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Headstage AxonInstruments, Union City, CA, United States CV203BU
Interface Scientifica, Uckfield, UK 1U Rack, 352036
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control software Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PP-830
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
Motorised Micromanipulator Scientifica, Uckfield, UK PatchStar
Optical power meter Thorlabs, Newton, NJ, United States PM100D
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Silver wire A-M Systems, Sequim, WA, United States 787500 Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet
Soda lime glass capillaries Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark 160213 BRIS, ISO12772 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Equipment - Carbon fiber
Carbon fibers provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec BZ:00
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States 1550B
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Fluorescence System Interface IonOptix, Milton, MA United States FSI-800 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Force Transducer System Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada 406A
Glass capillaries for force measurements Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States GC200F-10
Interface National Instruments National Instruments, Budapest, Hungary BNC-2110
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control box Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Microcontroller Parallax Inc., Rocklin, California, United States Propeller
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PC-10
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
MyoCam-S camera IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S camera Power IonOptix, Milton, MA, United States MCS-100
MyoPacer Field Stimulator IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States MYP100
Piezo Motor Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany E-501.00
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software IonWizard IonOptix, Dublin, Ireland Version 6.6.10.125
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Chemicals
Adenosine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9251-100G
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A7030-50G
CaCl2 Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 21114-1L
L-Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C9500-25G
Collagenase type 2, 315 U/mg Worthington, Lakewood, NJ, USA LS004177
Creatine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C0780-50G
Cytosine-β-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C1768-100MG
EGTA Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 3054.3
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany PZN-07829486
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States F9665
Gentamycin 50 mg/mL Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA 15750-037
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States G7021-1KG
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany PZN-03029843
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States H3375-1KG
Insulin (bovine pancreas) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States I6634-50MG
K-aspartate Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A6558-25G
KCl VWR International GmbH, Leuven, Belgium 26764.260 1 mg/mL
KOH Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 35113-1L
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States L2020-1MG
M199-Medium Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States M4530
Mg-ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9187-1G
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States 63069-500ML
NaCl Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK 10428420
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
NaOH AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany A6579 without Ca2+/Mg2+
Na-pyruvat Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P2256-100MG
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States D1408-500ML
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma, Poole, UK 192066
Protease XIV from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P5147-1G
Taurine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States T0625-500G
Thiopental Inresa 0.5 g Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany PZN-11852249
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany PZN-01320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harz, H., Hegemann, P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas. Nature. 351, 489-491 (1991).
  2. Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature. 271, 476-478 (1978).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  7. Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium. Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).
  8. Schobert, B., Lanyi, J. K. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).
  9. Inoue, K., et al. A light-driven sodium ion pump in marine bacteria. Nature Communications. 4, 1678 (2013).
  10. Han, X., et al. A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).
  11. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  12. Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2. Scientific Reports. 8, 9316 (2018).
  13. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).
  14. Berndt, A. Structure-Guided Transformation. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).
  15. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  16. Mohamed, G. A., et al. Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins. BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).
  17. Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing. Scientific Reports. 7, 13823 (2017).
  18. Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics. Scientific Reports. 6, 33530 (2016).
  19. Kopton, R. A., et al. Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels. Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).
  20. Peyronnet, R., et al. Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Nishimura, S., et al. Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).
  23. Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).
  24. Burton, R. A. B., et al. Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation. Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).
  25. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  26. Janssen, P. M., Hunter, W. C. Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction. The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).
  27. Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).
  28. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  29. Schneider-Warme, F., Ravens, U. Using light to fight atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).
  30. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
  31. Bernal Sierra, Y. A., et al. Potassium channel-based optogenetic silencing. Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).
  32. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).

Tags

Medicin Naturlig anjon channelrhodopsin GtACR1 Guillardia theta hjärta kardiomyocyter optogenetik aktionspotential hjärtelektrofysiologi kolfiberteknik kontraktilitet kraftmätning mekanik
Elektromekanisk bedömning av optogenetiskt modulerad kardiomyocytaktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss,… More

Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss, R., Kohl, P., Peyronnet, R., Schneider-Warme, F. Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity. J. Vis. Exp. (157), e60490, doi:10.3791/60490 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter