Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo
Summary
Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.
Abstract
Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) são transmitidos por moscas brancas do complexo Bemisia tabaci de forma persistente e circulativa. Considerando os extensos danos causados pelas begomovírus à produção em todo o mundo, é imperativo entender a interação entre begomovírus e seu vetor whitefly. Para isso, a localização e quantificação do vírus nos tecidos vetoris é crucial. Aqui, usando o vírus do cacho de folha amarela de tomate (TYLCV) como exemplo, descrevemos um protocolo detalhado para localizar begomovírus em midguts whitefly, glândulas salivares primárias e ovários por imunofluorescência. O método baseia-se no uso de anticorpos específicos contra uma proteína de casaco de vírus, anticorpos secundários rotulados com tinta de tinta e um microscópio confocal. O protocolo também pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV em midguts whitefly, glândulas salivares primárias, hemolinsina e ovários por PCR quantitativo (qPCR). Usando primers especificamente projetados para TYLCV, os protocolos de quantificação permitem a comparação da quantidade de TYLCV em diferentes tecidos da mosca branca. O protocolo descrito é potencialmente útil para a quantificação de begomovírus no corpo de uma mosca branca e de uma planta infectada pelo vírus. Esses protocolos podem ser usados para analisar a via de circulação das begomovírus no whitefly ou como um complemento a outros métodos para estudar interações whitefly-begomovírus.
Introduction
Nas últimas décadas, as begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) causaram sérios danos à produção de muitas culturas vegetais, fibras e ornamentais em todo o mundo1. Os begomovírus são transmitidos de forma persistente pela mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que é uma espécie complexa que contém mais de 35 espécies enigmáticas2,3. Begomovírus podem afetar direta ou indiretamente a fisiologia e o comportamento da mosca branca, como fecundidade4, longevidade4, e preferência hospedeira5,6. Além disso, a eficiência de transmissão de uma determinada espécie/cepa de begomovírus varia para diferentes espécies enigmáticas whitefly mesmo as mesmas condições experimentais7,8,9,10,indicando que há uma interação complexa entre begomovírus e moscas brancas. Para entender melhor os mecanismos subjacentes às interações whitefly-begomovírus, localização e quantificação do vírus em tecidos whitefly são essenciais.
O vírus do enrolamento da folha amarela de tomate (TYLCV) é um begomovírus que foi relatado pela primeira vez em Israel, mas hoje causa sérios danos à produção de tomate em todo o mundo11,12. Devido à sua importância econômica, é uma das begomovírus mais bem estudadas13. Como outros begomovírus monopartitanos, TYLCV é um vírus de DNA circular de uma única cadeia com um tamanho de genoma de cerca de 2.800 nucleotídeos14. Enquanto ainda estão em debate, várias linhas de evidências apoiam a replicação do TYLCV em moscas brancas15,16,17. Além disso, a interação de partículas TYLCV e proteínas whitefly foi relatada6,18,19,20. Para a transmissão do vírus, moscas brancas adquirem TYLCV alimentando-se de plantas infectadas pelo vírus, virões passam pelo canal de alimentos para chegar ao esôfago, penetrar na parede do intestino para alcançar o hemolinsina e, em seguida, translocalizar-se nas glândulas salivares primárias (PSGs). Finalmente, as viriões são espumeded com saliva ao longo do ducto salivar em phloem vegetal21. Além disso, vários estudos mostram que o TYLCV é capaz de ser transmitido transovarialmente de moscas brancas femininas para seus filhos22,23. Em outras palavras, para alcançar a transmissão produtiva, o vírus tem que superar barreiras celulares dentro da mosca branca para translocalizar de um tecido para outro. Durante o cruzamento dessas barreiras, é provável que ocorram interações entre whitefly e proteínas do vírus, provavelmente determinando a eficiência com que os vírus são transmitidos.
Imunofluorescência é uma técnica comumente utilizada para análise de distribuição de proteínas. A especificidade dos anticorpos ligados ao seu antígeno forma a base da imunofluorescência. Devido à importância econômica do TYLCV, anticorpos monoclonais contra a proteína do casaco TYLCV foram desenvolvidos, oferecendo uma maneira altamente sensível de localizar o vírus24. O PCR Quantitativo (qPCR) permite quantificação sensível e específica de ácidos nucleicos. Esta técnica é mais frequentemente baseada no uso de sonda de hidrolise (por exemplo, TaqMan) ou corante fluorescente (por exemplo, SYBR Green). Para qPCR à base de sondas de hidrólise, são necessárias sondas específicas, o que consequentemente aumenta o custo. QPCR fluorescente baseado em corante é mais simples e econômico, porque as sondas de hibridização específicas de amplicon rotuladas não são necessárias25. Até agora, vários estudos têm usado imunofluorescência e qPCR, juntamente com outros métodos para investigar as complexas interações begomovírus-whitefly. Por exemplo, Pan et al. realizaram análise spcr e imunofluorescência do vírus em tecidos whitefly e descobriram que a diferença na capacidade de transmitir o vírus de tiro encaracolado (TbCSV) entre as espécies whitefly AsiaII 1 e Oriente Médio Asia Minor 1 (MEAM1) foi devido ao vírus ser capaz de atravessar eficientemente a parede midgut da AsiaII1, mas não MEAM18. Da mesma forma, enquanto moscas brancas do Mediterrâneo (MED) podem transmitir facilmente TYLCV, eles não conseguem transmitir o vírus chinês de folha amarela de tomate (TYLCCNV). A transmissão seletiva foi investigada por meio da imunofluorescência de detecção de vírus nos PSGs, o que mostrou que o TYLCCNV não cruza facilmente os PSGs de moscas brancas MED26. A colocalização da imunofluorescência do TYLCV CP e a proteína do marcador de autofagia ATG8-II em midguts whitefly mostra que a autofagia desempenha um papel crítico na repressão da infecção de TYLCV no whitefly27.
Aqui, usando o TYLCV como exemplo, descrevemos um protocolo para a localização de begomovírus em midguts, PSGs e ovários de mosca-branca por uma técnica de imunofluorescência. A técnica inclui dissecação, fixação e incubação com anticorpos secundários de rótulos primários e de tinta. Sinais de fluorescência mostrando a localização de proteínas virais nos tecidos whitefly podem então ser detectados um microscópio confocal. Mais importante, este protocolo pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV usando qPCR à base de verde da SYBR em midguts whitefly, PSGs, hemolymph e ovários, que podem ser usados para comparar a quantidade de vírus em diferentes amostras de tecido whitefly.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um protocolo para localização e quantificação de um begomovírus nos tecidos de seu vetor whitefly por imunofluorescência e qPCR. A dissecação representa o primeiro passo para localizar e quantificar o vírus em tecidos whitefly. O corpo de mosca branca tem cerca de 1 mm de comprimento, o que significa que os tecidos são extremamente pequenos, e é difícil dissecá-los. Além disso, há fortes conexões entre os tecidos. Por exemplo, os ovários estão fortemente conectados com os bacteriócitos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Key Research and Development Program (Número de subvenção: 2017YFD0200600), o fundo destinado ao Sistema de Pesquisa agropecuária da China (número de subvenção: CARS-23-D07) e pela Fundação Bill & Melinda Gates (ID de Investimento OPP1149777777 ). Agradecemos ao Prof. Jian-Xiang Wu por fornecer anticorpos TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Referências
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