Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif
Summary
Nous décrivons une méthode d’immunofluorescence et quantitative de PCR pour la localisation et la quantification des bégomovirus dans les tissus d’insecte. Le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et vectorielles. Le protocole pcR quantitatif peut être étendu pour quantifier les virus dans des corps entiers de mouche blanche et des plantes infectées par le virus.
Abstract
Les begomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae)sont transmis par les mouches blanches du complexe Bemisia tabaci d’une manière persistante et circulative. Compte tenu des dommages considérables causés par les bégomovirus à la production agricole dans le monde entier, il est impératif de comprendre l’interaction entre les begomovirus et leur vecteur de mouche blanche. Pour ce faire, la localisation et la quantification du virus dans les tissus vectoriels sont cruciales. Ici, en utilisant le virus de boucle jaune de feuille de tomate (TYLCV) comme exemple, nous décrivons un protocole détaillé pour localiser des bégomovirus dans les midguts de mouche blanche, les glandes salivaires primaires, et les ovaires par immunofluorescence. La méthode est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques contre une protéine de couche virale, des anticorps secondaires étiquetés colorants et un microscope confocal. Le protocole peut également être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV dans les mouches blanches midguts, glandes salivaires primaires, hémolymphe, et ovaires par PCR quantitatif (qPCR). À l’aide d’amorces spécialement conçues pour TYLCV, les protocoles de quantification permettent de comparer la quantité de TYLCV dans différents tissus de la mouche blanche. Le protocole décrit est potentiellement utile pour la quantification des bégomovirus dans le corps d’une mouche blanche et d’une plante infectée par le virus. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser la voie de circulation des bégomovirus dans la mouche blanche ou comme complément à d’autres méthodes pour étudier les interactions whitefly-begomovirus.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les bégomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae) ont causé de graves dommages à la production de nombreux légumes, fibres et cultures ornementalesdansle monde 1 . Les begomovirus sont transmis de manière persistante par la mouche blanche Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), qui est une espèce complexe contenant plus de 35 espèces cryptiques2,3. Les begomovirus peuvent affecter directement ou indirectement la physiologie et le comportement des mouches blanches, tels que la fécondité4, la longévité4, et la préférence de l’hôte5,6. En outre, l’efficacité de transmission d’une espèce/souche de bégomovirus donnée varie pour différentes espèces cryptiques de mouches blanches même dans les mêmes conditions expérimentales7,8,9,10, indiquant qu’il existe une interaction complexe entre les bégomovirus et les mouches blanches. Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux interactions entre la mouche blanche et le bégomovirus, la localisation et la quantification du virus dans les tissus de la mouche blanche sont essentiels.
Le virus de la courbure jaune de la tomate (TYLCV) est un bégomovirus qui a été signalé pour la première fois en Israel, mais qui cause aujourd’hui de graves dommages à la production mondiale de tomates11,12. En raison de son importance économique, il est l’un des bégomovirus les mieux étudiés13. Comme d’autres bégomovirus monopartites, TYLCV est un virus de l’ADN circulaire à brin unique dont la taille du génome est d’environ 2 800 nucléotides14. Bien que toujours en débat, plusieurs lignes de preuve soutiennent la réplication de TYLCV chez les mouches blanches15,16,17. En outre, l’interaction des particules TYLCV et des protéines de la mouche blanche a été signalée6,18,19,20. Pour la transmission du virus, les mouches blanches acquièrent le TYLCV en se nourrissant de plantes infectées par le virus, les virions passent le long du canal alimentaire pour atteindre l’œsophage, pénètrent dans la paroi intermédiaire pour atteindre l’hémolymphe, puis se translocalisent dans les glandes salivaires primaires (GS). Enfin, les virions sont égeées avec de la salive le long du conduit salivaire dans le phlomevégétal 21. En outre, plusieurs études montrent que TYLCV est capable d’être transmis transovarialement des mouches blanches femelles à leur progéniture22,23. En d’autres termes, pour atteindre une transmission productive, le virus doit surmonter les barrières cellulaires à l’intérieur de la mouche blanche pour transloquer d’un tissu à l’autre. Pendant le franchissement de ces barrières, des interactions entre la mouche blanche et les protéines virales sont susceptibles de se produire, ce qui déterminera probablement l’efficacité avec laquelle les virus sont transmis.
L’immunofluorescence est une technique couramment utilisée pour l’analyse de la distribution de protéines. La spécificité des anticorps se liant à leur antigène forme la base de l’immunofluorescence. En raison de l’importance économique de TYLCV, des anticorps monoclonaux contre la protéine de couche TYLCV ont été développés, offrant un moyen très sensible de localiser le virus24. Le PCR quantitatif (qPCR) permet une quantification sensible et spécifique des acides nucléiques. Cette technique est le plus souvent basée sur l’utilisation de sondes hydrolysques (p. ex. TaqMan) ou de colorant fluorescent (p. ex., SYBR Green). Pour le qPCR à base de sonde d’hydrolyse, des sondes spécifiques sont nécessaires, ce qui augmente le coût. Le qPCR à base de colorant fluorescent est plus simple et plus rentable, car les sondes d’hybridation étiquetées spécifiques à l’amplicon ne sont pas nécessaires25. Jusqu’ici, plusieurs études ont employé l’immunofluorescence et le qPCR avec d’autres méthodes pour étudier les interactions complexes de begomovirus-whitefly. Par exemple, Pan et coll. ont effectué l’analyse qPCR et l’immunofluorescence du virus dans les tissus de la mouche blanche et ont constaté que la différence dans la capacité de transmettre le virus de la pousse bouclée du tabac (TbCSV) entre les espèces de mouches blanches AsiaII 1 et Moyen-Orient Asie mineure 1 (MEAM1) était due au fait que le virus était capable de traverser efficacement la paroi intermédiaire d’AsiaII1 mais pas MEAM18. De même, alors que les mouches blanches méditerranéennes (MED) peuvent facilement transmettre TYLCV, elles ne transmettent pas le virus de la chine de courbure jaune de tomate (TYLCCNV). La transmission sélective a été étudiée à l’aide de la détection d’immunofluorescence du virus dans les PSG, qui a montré que TYLCCNV ne traversent pas facilement les PSG des mouches blanchesMED 26. La colocalisation d’immunofluorescence de TYLCV CP et de la protéine de marqueur d’autophagie ATG8-II dans les mouches blanches montre que l’autophagie joue un rôle critique dans la répression de l’infection de TYLCV dans la mouche blanche27.
Ici, en utilisant TYLCV comme exemple, nous décrivons un protocole pour la localisation des begomovirus dans les mouches blanches, les PSG et les ovaires par une technique d’immunofluorescence. La technique comprend la dissection, la fixation et l’incubation avec des anticorps secondaires primaires et étiquetés par colorant. Les signaux de fluorescence montrant l’emplacement des protéines virales dans les tissus de la mouche blanche peuvent alors être détectés sous un microscope confocal. Plus important encore, ce protocole peut être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV utilisant le qPCR à base verte de SYBR dans les midguts de mouche blanche, les PSG, les hémolymphes, et les ovaires, qui peut être employé pour comparer la quantité de virus dans différents échantillons de tissu de mouche blanche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous décrivons un protocole pour la localisation et la quantification d’un bégomovirus dans les tissus de son vecteur de mouche blanche par immunofluorescence et qPCR. La dissection représente la première étape pour localiser et quantifier le virus dans les tissus de la mouche blanche. Le corps de la mouche blanche mesure environ 1 mm de longueur, ce qui signifie que les tissus sont extrêmement petits et qu’il est difficile de les disséquer. En outre, il existe des liens étroits entre les tissus. Par exem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program (numéro de subvention: 2017YFD0200600), le fonds affecté au Système de recherche agricole de la Chine (numéro de subvention : CARS-23-D07) et la Fondation Bill et Melinda Gates (Investment ID OPP1149777 ). Nous remercions le professeur Jian-Xiang Wu d’avoir fourni des anticorps TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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