免疫荧光和定量PCR对白蝇组织中白蝇病毒的定位和定量
Summary
我们描述了一种免疫荧光和定量PCR方法，用于昆虫组织中果子病毒的定位和定量。免疫荧光方案可用于共定病毒和载体蛋白。定量PCR协议可以扩展，以量化整个白蝇体内和受病毒感染的植物中的病毒。
Abstract
贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）由贝米西亚塔巴奇复合物的白蝇以持续、循环的方式传播。考虑到果虫病毒对全世界作物生产造成的广泛损害，必须了解果蝇病毒与其白蝇载体之间的相互作用。为此，在病媒组织中定位和定量病毒至关重要。在这里，以番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）为例，我们描述了一个详细的方案，通过免疫荧光在白蝇中肠道、原发唾液腺和卵巢中本地化果子病毒。该方法基于对病毒涂层蛋白、染料标记的二级抗体和共聚焦显微镜使用特定抗体。该协议还可用于共同本地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了通过定量PCR（qPCR）对白蝇中肠、原发性唾液腺、淋巴和卵巢中的TYLCV进行定量的一个方案。使用专为TYLCV设计的引基，定量协议允许比较白蝇不同组织中的TYLCV量。所述协议对于白蝇和受病毒感染植物体内的果子病毒的定量可能有用。这些协议可用于分析白蝇中贝戈病毒的循环途径，或作为研究白蝇-白蝇-白蝇病毒相互作用的其他方法的补充。
Introduction
在过去的几十年里，贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）已经给全世界许多蔬菜、纤维和观赏作物的生产造成了严重损害。贝戈莫病毒由白蝇贝米西亚·塔巴奇（赫米特拉：阿莱罗迪达）持续传播，这是一种复杂的物种，包含超过35个神秘的物种2，3。白蝇病毒可能直接或间接地影响白蝇的生理和行为，如粪便4、长寿4和宿主偏好5、6。此外，即使在相同的实验条件下，在相同的实验条件下，特定白蝇病毒物种/菌株的传播效率也因不同的白蝇神秘物种而异，这表明白蝇与白蝇之间存在复杂的相互作用。为了更好地了解白蝇-白蝇病毒相互作用背后的机制，在白蝇组织中对病毒进行定位和定量至关重要。
番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是一种在以色列首次报告的果子病毒，但如今对全世界番茄生产造成了严重破坏。由于其经济重要性，它是研究最好的贝戈病毒13之一。像其他单部分体细胞病毒一样，TYLCV是一种单链圆形DNA病毒，其基因组大小约为2，800个核苷酸14。虽然仍在争论中，几行证据支持在白蝇15，16，17复制TYLCV。此外，TYLCV粒子和白蝇蛋白的相互作用已经报告6，18，19，20。对于病毒传播，白蝇通过喂食受病毒感染的植物获得TYLCV，病毒通过食物管到达食道，穿透中肠道壁到达溶血区，然后转移到主要的唾液腺（PSG）。最后，病毒通过唾液管沿着唾液管道进入植物噬菌体21。此外，几项研究表明，TYLCV能够从雌性白蝇的转传传给它们的后代22，23。换句话说，为了实现生产性传播，病毒必须克服白蝇体内的细胞屏障，才能从一个组织转移到另一个组织。在跨越这些障碍期间，白蝇和病毒蛋白之间很可能发生相互作用，这可能决定病毒的传播效率。
免疫荧光是蛋白质分布分析常用技术。抗体与其抗原结合的特异性是免疫荧光的基础。由于TYLCV的经济意义，针对TYLCV涂层蛋白的单克隆抗体已经开发出来，为病毒24的局部化提供了一种高度敏感的方法。定量PCR（qPCR）允许对核酸进行敏感和具体的定量。该技术最常基于水解探针（例如，TaqMan）或荧光染料（如SYBR绿色）检测。对于基于水解探针的qPCR，需要特定的探头，从而增加了成本。荧光染料qPCR更简单，更具成本效益，因为标记的放大里昂特异性杂交探头不需要25。到目前为止，一些研究已经使用免疫荧光和qPCR以及其他方法来研究复杂的果子病毒-白蝇相互作用。例如，Pan等人对白蝇组织中的病毒进行了qPCR和免疫荧光分析，发现白蝇物种亚洲II 1和东亚小1（MEAM1）之间传播烟草卷曲病毒的能力差异是由于该病毒能够有效地穿过亚洲的中肠道壁，而不是MEAM18。同样，虽然地中海（MED）白蝇可以轻易传播TYLCV，但它们不能传播番茄黄叶卷曲中国病毒（TYLCCNV）。使用PSG中病毒的免疫荧光检测对选择性传播进行了研究，结果表明TYLCCNV不容易穿过MED白蝇26的PSG。TYLCV CP和白蝇中古的自噬标记蛋白ATG8-II的免疫荧光共定位表明，自噬在抑制白蝇27的TYLCV感染中起着关键作用。
在这里，我们以TYLCV为例，描述了一种通过免疫荧光技术在白蝇中肠道、PSG和卵巢中定位的果子病毒的协议。该技术包括用原抗体和染料标记的二级抗体进行解剖、固定和孵育。荧光信号显示病毒蛋白在白蝇组织中的位置，然后可以在共聚焦显微镜下检测到。更重要的是，该协议可用于共同地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了在白蝇中古、PSG、淋巴和卵巢中使用SYBR绿色qPCR对TYLCV进行定量的协议，该协议可用于比较不同白蝇组织样本中的病毒量。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一种方案，用于通过免疫荧光和qPCR在其白蝇载体的组织中定位和定量果蝇病毒。解剖是白蝇组织中对病毒进行本地化和量化的第一步。白蝇的身体长约1毫米，这意味着组织非常小，很难解剖它们。此外，组织之间有很强的联系。例如，卵巢与细菌紧密结合，使其难以分离。在这里，考虑到不同组织的特点和位置，我们描述了不同的解剖方法。然而，需要大量的实践来快速准?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家重点研究与发展计划（赠款号：2017YFD0200600）、中国农业研究系统专项资金（赠款号：CARS-23-D07）和比尔和梅林达·盖茨基金会（投资IDOPP1149777）的支持。).我们感谢吴建祥教授提供TYLCV CP抗体。
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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