Локализация и количественная оценка бегомовирусов в тканях Whitefly с помощью иммунофлуоресценции и количественного ПЦР
Summary
Мы описываем иммунофлуоресценцию и количественный метод ПЦР для локализации и количественной оценки бегомовирусов в тканях насекомых. Протокол иммунофлуоресценции может быть использован для колокализации вирусных и векторных белков. Количественный протокол ПЦР может быть распространен на количественную оценку вирусов в целых телах белокрылок и зараженных вирусом растениях.
Abstract
Бегомовирусы (род Begomovirus,семейство Geminiviridae) передаются белокрылками комплекса Bemisia tabaci в стойком, циркулятивном порядке. Учитывая значительный ущерб, наносимый бегомовирусами сельскохозяйственному производству во всем мире, крайне важно понять взаимодействие между бегомовирусами и их вектором белокрылки. Для этого крайне важно ею является локализация и количественная оценка вируса в векторных тканях. Здесь, используя томатный желтый лист локон вируса (TYLCV) в качестве примера, мы описываем подробный протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, первичных слюнных желез, и яичников иммунофлуоресценции. Метод основан на использовании специфических антител против белка вирусного пальто, красителя помечены вторичные антитела, и конфокальный микроскоп. Протокол также может быть использован для колокализации белок бегомовир и белокрылки. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV в белокрылых мидгутах, первичных слюнных железах, гемолимфе и яичниках количественным ПЦР (qPCR). Используя праймеры, специально разработанные для TYLCV, протоколы количественной оценки позволяют сравнивать количество TYLCV в различных тканях белокрылки. Описанный протокол потенциально полезен для количественной оценки бегоговирусов в организме белокрылки и зараженного вирусом растения. Эти протоколы могут быть использованы для анализа путей циркуляции begomoviruses в белокрылки или в качестве дополнения к другим методам для изучения белокрыль-бегомовирусных взаимодействий.
Introduction
В последние десятилетия, begomoviruses (род Begomovirus, семья Geminiviridae) нанесли серьезный ущерб производству многих овощей, клетчатки и декоративных культур во всем мире1. Begomoviruses передаются в постоянной манере белокрыли Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), который является сложным видом, содержащим более 35 загадочных видов2,3. Begomoviruses может прямо или косвенно повлиять на белокрыль физиологии и поведения, таких как плодовитость4, долговечность4, и хост предпочтения5,6. Кроме того, эффективность передачи данного вида бегоговируса /деформации варьируется для различных белокрылок загадочных видов даже при тех же экспериментальных условиях7,8,9,10, что свидетельствует о том, что существует сложное взаимодействие между begomoviruses и белокрылки. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе белокрыль-бегомовирусных взаимодействий, важное значение имеют локализация и количественная оценка вируса в тканях белокрылки.
Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) является begomovirus, который был впервые зарегистрирован в Израиле, но в настоящее время вызывает серьезный ущерб производству томатов во всем мире11,12. Благодаря своей экономической значимости, это один из наиболее изученных бегомовирусов13. Как и другие монопартитные бегомовирусы, TYLCV является одноцепочным круговым вирусом ДНК с размером генома около 2800 нуклеотидов14. Хотя все еще обсуждается, несколько линий доказательств подтверждают репликации TYLCV в белых мух15,16,17. Кроме того, взаимодействие частиц TYLCV и белокрылых белков было зарегистрировано6,18,19,20. Для передачи вируса, белые мухи приобретают TYLCV путем подачи на зараженных вирусом растений, virions проходят вдоль пищевода, чтобы достичь пищевода, проникнуть в середине гут стены для достижения гемолимфы, а затем трансопределить в первичных слюнных желез (PSGs). Наконец, virions egested со слюной вдоль слюнного протока в флома21растений . Кроме того, несколько исследований показывают, что TYLCV может быть трансovarially передается от женщин белокрылки их потомство22,23. Другими словами, для достижения продуктивной передачи, вирус должен преодолеть клеточные барьеры в белокрылке, чтобы перенести из одной ткани в другую. Во время пересечения этих барьеров, взаимодействия между белокрыльи и вирус белков, вероятно, происходит, вероятно, определение эффективности, с которой вирусы передаются.
Иммунофлуоресценция является широко используемым методом для анализа распределения белка. Специфика связывающихся с их антигеном антител является основой иммунофлуоресценции. В связи с экономической значимостью TYLCV, моноклональные антитела против белка покрытия TYLCV были разработаны, предлагая очень чувствительный способ локализации вируса24. Количественный ПЦР (qPCR) позволяет чувствительной и специфической количественной оценки нуклеиовых кислот. Этот метод чаще всего основан на использовании гидролизного зонда (например, TaqMan) или флуоресцентного красителя (например, SYBR Green) обнаружения. Для гидролизового зонда на основе qPCR, конкретные зонды необходимы, что, следовательно, увеличение стоимости. Флуоресцентный краситель на основе qPCR проще и более экономически эффективным, потому что помеченные ампликон-специфические гибридизации зонды не требуется25. До сих пор, несколько исследований использовали иммунофлуоресценции и qPCR наряду с другими методами для исследования сложных взаимодействия begomovirus-whitefly. Например, Pan et al. провели qPCR и иммунофлуоресценцию анализа вируса в белокрыльных тканях и обнаружили, что разница в способности передавать вирус вьющихся табачных изделий (TbCSV) между видами белокрылок AsiaII 1 и Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) была обусловлена тем, что вирус способен эффективно пересекать стену мидгута АзииII1, но не MEAM18. Аналогичным образом, в то время как средиземноморские (MED) белые мухи могут легко передавать TYLCV, они не передают томатный желтый лист завивка Китай вирус (TYLCCNV). Селективная передача была исследована с помощью иммунофлуоресценции обнаружения вируса в PSGs, который показал, что TYLCCNV не легко пересечь PSGs МЕД белокрылки26. Иммунофлуоресценция солокализации TYLCV CP и аутофагии маркер белка ATG8-II в белокрыль midguts показывает, что аутофагия играет важную роль в подавлении инфекции TYLCV в белокрыль27.
Здесь, используя TYLCV в качестве примера, мы описываем протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, PSGs, и яичников с помощью иммунофлуоресценции техники. Техника включает в себя вскрытие, фиксация и инкубация с первичными и красителя этикетки вторичных антител. Сигналы флуоресценции, показывающие расположение вирусных белков в тканях белокрылки, могут быть обнаружены под конфокальный микроскоп. Что еще более важно, этот протокол может быть использован для колокализации begomoviral и белокрылки белков. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV с использованием SYBR Зеленый основе qPCR в белокрыль midguts, PSGs, гемолимфы, и яичники, которые могут быть использованы для сравнения количества вируса в различных образцов белокрылки ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для локализации и количественной оценки бегомовируса в тканях его белокрыльного вектора иммунофлюоресценцией и qPCR. Рассечение представляет собой первый шаг к локализации и количественной оценки вируса в тканях белокрылки. Тело белокрылки около 1 мм в длин?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок (Грант номер: 2017YFD0200600), целевой фонд для Китая сельскохозяйственной исследовательской системы (грант номер: CARS-23-D07) и Билл и Мелинда Гейтс Фонд (Инвестиционный ID OPP11497777 ). Мы благодарим профессора Цзянь-Сян Ву за предоставление антител TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Referências
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
