Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo
Summary
Descriviamo un’immunofluorescenza e un metodo PCR quantitativo per la localizzazione e la quantificazione dei begomovirus nei tessuti degli insetti. Il protocollo di immunofluorescenza può essere utilizzato per co-localizzare proteine virali e vettoriali. Il protocollo PCR quantitativo può essere esteso per quantificare i virus in corpi di mosca intero e piante infettate da virus.
Abstract
I begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) sono trasmessi da mosche bianche del complesso bemisia tabaci in modo persistente e circolativo. Considerando gli ingenti danni causati dai begomovirus alla produzione agricola in tutto il mondo, è imperativo comprendere l’interazione tra i begomovirus e il loro vettore di mosche bianche. Per farlo, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti vettoriali è fondamentale. Qui, usando il virus del ricciolo delle foglie gialle di pomodoro (TYLCV) come esempio, descriviamo un protocollo dettagliato per localizzare i begomovirus nei midguts delle lamiche bianche, nelle ghiandole salivari primarie e nelle ovaie per immunofluorescenza. Il metodo si basa sull’uso di anticorpi specifici contro una proteina del mantello di virus, anticorpi secondari etichettati con coloranti e un microscopio confocale. Il protocollo può essere utilizzato anche per colocalizzare le proteine begomvirale e della mosca bianca. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione del TYLCV nei midgut sottabi, nelle ghiandole salivari primarie, nell’emolymph e nelle ovaie per PCR quantitativo (qPCR). Utilizzando primer specificamente progettati per TYLCV, i protocolli per la quantificazione consentono il confronto della quantità di TYLCV in diversi tessuti della mosca bianca. Il protocollo descritto è potenzialmente utile per la quantificazione dei begomovirus nel corpo di una mosca bianca e di una pianta infettata da virus. Questi protocolli possono essere utilizzati per analizzare la via di circolazione dei begomovirus nella mosca bianca o come complemento ad altri metodi per studiare le interazioni bianco-begomovirus.
Introduction
Negli ultimi decenni, i begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) hanno causato gravi danni alla produzione di molte colture vegetali, fibre e ornamentali in tutto il mondo1. I begomovirus sono trasmessi in modo persistente dalla mosca bianca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), che è una specie complessa che contiene oltre 35 specie criptiche2,3. I begomovirus possono influenzare direttamente o indirettamente la fisiologia e il comportamento delle mosche bianche, come la fecondità4,la longevità4e la preferenza host5,6. Inoltre, l’efficienza di trasmissione di una determinata specie/ceppo di begomovirus varia per diverse specie criptiche della mosca bianca anche nelle stesse condizioni sperimentali7,8,9,10, indicando che esiste una complessa interazione tra begomovirus e mosche bianche. Per comprendere meglio i meccanismi alla base delle interazioni bianco-begomovirus, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti della mosca bianca sono essenziali.
Pomodoro giallo foglia curl virus (TYLCV) è un begomovirus che è stato segnalato per la prima volta in Israele, ma al giorno d’oggi provoca gravi danni alla produzione di pomodoro in tutto il mondo11,12. Grazie alla sua importanza economica, è uno dei begomovirus più studiati13. Come altri virus begomovirus monopartitici, TYLCV è un virus del DNA circolare a singolo filamento con una dimensione del genoma di circa 2.800 nucleotidi14. Mentre ancora in discussione, diverse linee di prova supportano la replica di TYLCV in whiteflies15,16,17. Inoltre, l’interazione delle particelle TYLCV e delle proteine delle mosche bianche è stata segnalata6,18,19,20. Per la trasmissione del virus, le mosche bianche acquisiscono TYLCV nutrendosi di piante infettate dal virus, i virioni passano lungo il canale alimentare per raggiungere l’esofago, penetrano nella parete centrale per raggiungere l’emolfo, quindi si traslocano nelle ghiandole salivari primarie (PSG). Infine, i virioni sono estratta con saliva lungo il condotto salivare in phloem21. Inoltre, diversi studi dimostrano che TYLCV è in grado di essere trasmesso transovarialmente dalle mosche bianche femminili alla loro prole22,23. In altre parole, per ottenere una trasmissione produttiva, il virus deve superare le barriere cellulari all’interno della moschea bianca per traslocare da un tessuto all’altro. Durante l’attraversamento di queste barriere, è probabile che si verifichino interazioni tra le proteine delle mosche bianche e del virus, probabilmente determinando l’efficienza con cui i virus vengono trasmessi.
L’immunofluorescenza è una tecnica comunemente utilizzata per l’analisi della distribuzione delle proteine. La specificità degli anticorpi che si legano al loro antigene costituiscono la base dell’immunofluorescenza. A causa dell’importanza economica di TYLCV, sono stati sviluppati anticorpi monoclonali contro la proteina del cappotto TYLCV, offrendo un modo altamente sensibile per localizzare il virus24. La BICR quantitativa (qPCR) consente la quantificazione sensibile e specifica degli acidi nucleici. Questa tecnica si basa più frequentemente sull’uso di sonda idrolisi (ad esempio TaqMan) o rilevamento di coloranti fluorescente (ad esempio, SYBR Green). Per qPCR basato su sonda idrolisi, sono necessarie sonde specifiche, che di conseguenza aumentano il costo. Il qPCR fluorescente basato su coloranti è più semplice e conveniente, perché le sonde di ibridazione specifiche per amplicon etichettate non sono richieste25. Finora, diversi studi hanno usato l’immunofluorescenza e il qPCR insieme ad altri metodi per studiare le complesse interazioni begomovirus-mosca bianca. Ad esempio, Pan et al. ha eseguito l’analisi qPCR e immunofluorescenza del virus nei tessuti della mosca bianca e ha scoperto che la differenza nella capacità di trasmettere il virus del germoglio riccio di tabacco (TbCSV) tra le specie di mosca bianca AsiaII 1 e Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) era dovuta al fatto che il virus era in grado di attraversare in modo efficiente la parete centrale dell’AsiaII1 ma non MEAM18. Allo stesso modo, mentre le mosche bianche mediterranee (MED) possono trasmettere facilmente TYLCV, non riescono a trasmettere il virus cinese a ricciolo a foglia gialla pomodoro (TYLCCNV). La trasmissione selettiva è stata studiata utilizzando il rilevamento dell’immunofluorescenza del virus nei PSG, il che ha dimostrato che tyLCCNV non attraversa facilmente i PSG delle mosche bianche MED26. La co-localizzazione dell’immunofluorescenza di TYLCV CP e la proteina marcatore di autofagia ATG8-II nei midguts della mosca bianca mostrano che l’autofagia svolge un ruolo fondamentale nel reprimere l’infezione di TYLCV nella moschea bianca27.
Qui, usando TYLCV come esempio, descriviamo un protocollo per la localizzazione dei begomovirus nei midgut, nei PSG e nelle ovaie con una tecnica di immunofluorescenza. La tecnica include la dissezione, la fissazione e l’incubazione con anticorpi secondari primari e con coloranti. I segnali di fluorescenza che mostrano la posizione delle proteine virali nei tessuti della mosca bianca possono quindi essere rilevati al microscopio confocale. Ancora più importante, questo protocollo può essere utilizzato per colocalizzare proteine begomovirale e whitefly. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione di TYLCV utilizzando QPCR a base verde SYBR in midgut, PSG, emolymph e ovaie, che può essere utilizzato per confrontare la quantità di virus in diversi campioni di tessuto a mosca bianca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un protocollo per la localizzazione e la quantificazione di un begomovirus nei tessuti del suo vettore di mosca bianca per immunofluorescenza e qPCR. La dissezione rappresenta il primo passo per localizzare e quantificare il virus nei tessuti delle mosche bianche. Il corpo della mosca bianca è di circa 1 mm di lunghezza, il che significa che i tessuti sono estremamente piccoli, ed è difficile sezionarli. Inoltre, ci sono forti connessioni tra i tessuti. Ad esempio, le ovaie sono strettamente collegate a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program (Numero di sovvenzione: 2017YFD0200600), il fondo stanziato per il China Agriculture Research System (numero di sovvenzione: CARS-23-D07) e la Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Ringraziamo jian-Xiang Wu per aver fornito anticorpi TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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