면역형광 및 정량적 PCR에 의한 화이트플라이 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화
Summary
우리는 곤충 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 면역형광 및 정량적 PCR 방법을 기술한다. 면역형광 프로토콜은 바이러스 및 벡터 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 정량적 PCR 프로토콜은 전체 화이트플라이 바디 및 바이러스 감염 식물에서 바이러스를 정량화하기 위해 확장될 수 있다.
Abstract
베고모바이러스(베고모바이러스,가족 쌍둥이자리)는 베미시아 타바치 복합체의 흰파리에 의해 지속적이고 순환적인 방식으로 전달된다. 전 세계적으로 작물 생산에 베고모 바이러스로 인한 광범위한 손상을 고려, 베고모 바이러스와 그들의 흰 파리 벡터 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이렇게 하려면 벡터 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 중요합니다. 여기서, 예를 들어 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)를 사용하여, 우리는 면역형광에 의한 백딧지, 1차 타액선 및 난소에서 베고모바이러스를 국소화하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 바이러스 코트 단백질, 염료 표지 이차 항체 및 공초점 현미경에 대한 특정 항체의 사용에 기초한다. 프로토콜은 또한 베고모바이러스 및 흰플라이 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 우리는 또한 양적 PCR (qPCR)에 의하여 흰살 파리 중두, 1 차 적인 타액 선, 헤모 림프 및 난소에 있는 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다. TYLCV를 위해 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 정량화를 위한 프로토콜은 화이트플라이의 상이한 조직에서 TYLCV의 양을 비교하는 것을 허용한다. 기재된 프로토콜은 화이트플라이 및 바이러스에 감염된 식물의 체내에서 베고모바이러스의 정량화에 잠재적으로 유용하다. 이 프로토콜은 화이트플라이에서 베고모바이러스의 순환 경로를 분석하거나 화이트플라이-베고모바이러스 상호작용을 연구하는 다른 방법에 대한 보완으로 사용될 수 있다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 베고모바이러스(Begomovirus, 가족 쌍둥이자리)는전 세계적으로 많은 채소, 섬유질 및 장식용 작물의 생산에 심각한 손상을 입혔습니다1. 베고모바이러스는 35종 이상을 포함하는 복합종인 흰파리 베미시아 타바치(Hemiptera: Aleyrodidae)에 의해 지속적으로전달된다. 베고모바이러스는 백딧항 4, 장수4,호스트 선호도5,6과 같은 백딧물 생리학 및 행동에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 주어진 베고모바이러스 종/균주의 투과 효율은 동일한 실험조건7,8,9,10하에서도다른 흰동비 비밀 종에 대해 다양하며, 이는 베고모바이러스와 흰파리 사이에 복잡한 상호작용이 있음을 나타낸다. 화이트플라이-베고모바이러스 상호 작용의 근본적인 메커니즘을 더 잘 이해하려면, 흰파리 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 필수적입니다.
토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)는 이스라엘에서 처음 보고되었지만 요즘에는 전 세계적으로 토마토 생산에 심각한 손상을 입히는 베고모바이러스(TYLCV)이다. 경제적 중요성으로 인해 가장 잘 연구 된 베고모 바이러스13중 하나입니다. 다른 모노파르트 베고모바이러스와 마찬가지로, TYLCV는 약 2,800개의 뉴클레오티드14의게놈 크기를 가진 단일 가닥 원형 DNA 바이러스이다. 여전히 논쟁 중, 증거의 여러 줄은 흰 파리에서 TYLCV의 복제를 지원15,16,17. 더욱이, TYLCV 입자와 흰플라이 단백질의 상호작용은6,18,19,20으로보고되었다. 바이러스 전염을 위해, 흰파리는 바이러스에 감염된 식물에 공급하여 TYLCV를 취득하고, 비리온은 식도에 도달하기 위해 음식 운하를 따라 통과하고, 헤모 림프에 도달하기 위해 중구 벽을 관통한 다음, 1 차 적인 침샘 (PSGs)으로 옮겨갑니다. 마지막으로, 비리온은 침관을 따라 침을 식물 phloem21로예시한다. 게다가, 몇몇 연구 결과는 TYLCV가 그들의 자손22,23에암컷 흰파리에서 transovarially 전달될 수 있다는 것을 보여줍니다. 즉, 생산적인 전염을 달성하기 위해, 바이러스는 한 조직에서 다른 조직으로 옮기기 위해 백색가비 내의 세포 장벽을 극복해야 한다. 이 장벽의 교차 도중, whitefly와 바이러스 단백질 사이 상호 작용은 아마 바이러스가 전송되는 효율성을 결정하는, 일어날 확률이 높습니다.
면역형광은 단백질 분포 분석을 위해 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그들의 항원과 결합하는 항체의 특이성은 면역 형광의 기초를 형성한다. TYLCV의 경제적 중요성으로 인해, TYLCV 코트 단백질에 대한 단일 클론 항체가 개발되어 바이러스24를국소화하는 매우 민감한 방법을 제공합니다. 정량적 PCR(qPCR)은 핵산의 민감하고 구체적인 정량화를 가능하게 합니다. 이 기술은 가수분해 프로브(예를 들어, TaqMan) 또는 형광 염료(예를 들어, SYBR Green) 검출의 사용에 가장 자주 기초한다. 가수분해 프로브 기반 qPCR의 경우 특정 프로브가 필요하므로 비용이 증가합니다. 형광 염료 기반 qPCR은 라벨이 부착된 앰플리톤 특이적 혼성화 프로브가25를필요로 하지 않기 때문에 더 간단하고 비용 효율적입니다. 지금까지, 몇몇 연구 결과는 복잡한 begomovirus-흰파리 상호 작용을 조사하기 위하여 그밖 방법과 더불어 면역 형광 및 qPCR를 이용했습니다. 예를 들어, Pan et al.은 백색파리 조직에서 바이러스의 qPCR 및 면역형광 분석을 수행하고 백색파리 종 아시아II 1과 중동 아시아 소소1(MEAM1) 사이의 담배 경투 바이러스(TbCSV)를 전송하는 능력의 차이가 아시아II1하지만MEAM1이아닌 아시아II1의 중거벽을 효율적으로 교차할 수 있는 바이러스에 기인한다는 것을 발견하였다. 유사하게, 지중해 (MED) 흰파리는 쉽게 TYLCV를 전송할 수 있지만, 그들은 토마토 노란 잎 컬 중국 바이러스 (TYLCCNV)를 전송하는 데 실패합니다. 선택적 전염은 PSGs에서 바이러스의 면역형광 검출을 사용하여 조사되었으며, 이는 TYLCCNV가 MED흰파리(26)의PSG를 쉽게 교차하지 않는 것으로 나타났다. 백색파리 미드구트에서 TYLCV CP 및 자가포식 마커 단백질 ATG8-II의 면역형광 동국화는 자가포식이 화이트플라이27에서TYLCV의 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
여기서, 예를 들어 TYLCV를 사용하여, 우리는 면역형광 기술에 의한 백비행 중거트, PSG 및 난소에서 베고모바이러스의 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 기술은 1 차및 염료 표지된 이차 항체를 가진 해부, 고정 및 배양을 포함합니다. 흰파리 조직에서 바이러스 성 단백질의 위치를 보여주는 형광 신호는 공초점 현미경으로 검출 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 베고모바이러스 및 흰파리 단백질을 국소화하는 데 사용될 수 있다. 우리는 또한 다른 whitefly 조직 견본에 있는 바이러스의 양을 비교하기 위하여 이용될 수 있는 백색파리 midguts, PSGs, hemolymph 및 난소에 있는 SYBR 녹색 기지를 둔 qPCR를 사용하여 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 면역형광 및 qPCR에 의한 백비행 벡터의 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 프로토콜을 기술한다. 해부는 흰파리 조직에서 바이러스를 현지화하고 정량화하는 첫 번째 단계를 나타냅니다. 화이트플라이 몸체는 길이가 약 1mm이며, 이는 조직이 매우 작으며 해부하기가 어렵습니다. 게다가, 조직 사이 강한 연결이 있습니다. 예를 들면, 난소는 박테리오시테와 단단히…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국가 주요 연구 개발 프로그램 (보조금 번호 : 2017YFD0200600), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 번호 : CARS-23-D07) 및 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (투자 ID OPP1149777)에 의해 지원되었습니다. ). TYLCV CP 항체를 제공한 지안샹 우 교수님께 감사드립니다.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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