Effektiv differentiering af postganglioniske sympatiske neuroner ved hjælp af humane pluripotente stamceller under Feeder-fri og kemisk definerede kulturbetingelser
Summary
I denne protokol beskriver vi en stabil, yderst effektiv differentieringsstrategi for generering af postganglioniske sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Denne model vil gøre neuroner til rådighed for brug af undersøgelser af flere autonome lidelser.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er blevet et effektivt redskab til sygdomsmodellering og studiet af menneskelig embryonal ebiotionisk udvikling in vitro. Vi har tidligere præsenteret en differentieringsprotokol for afledning af autonome neuroner med sympatisk karakter, der er blevet anvendt på patienter med autonom neuropati. Men protokollen blev bygget på Knock Out Serum Replacement (KSR) og feeder-baserede dyrkningbetingelser, og for at sikre høj differentieringeffektivitet var cellesortering nødvendig. Disse faktorer forårsager høj variation, høje omkostninger, og lav reproducerbarhed. Desuden er modne sympatiske egenskaber, herunder elektrisk aktivitet, ikke blevet verificeret. Her præsenterer vi en optimeret protokol, hvor PSC-kultur og differentiering udføres i feeder-fri og kemisk definerede dyrkningsbetingelser. Genetiske markører, der identificerer stammenneuralt våbenskjold, er identificeret. Yderligere differentiering i postganglionic sympatiske neuroner opnås efter 20 dage uden behov for cellesortering. Elektrofysiologisk optagelse viser yderligere den funktionelle neuron identitet. Fyring opdaget fra vores differentierede neuroner kan forbedres ved nikotin og undertrykt af adrenerge receptor antagonist propranolol. Mellemliggende sympatiske neurale sformere i denne protokol kan opretholdes som neurale sfæroider i op til 2 uger, som giver mulighed for udvidelse af kulturerne. Sammenfattende, vores opdaterede sympatiske neuron differentiering protokol viser høj differentiering effektivitet, bedre reproducerbarhed, mere fleksibilitet, og bedre neurale modning i forhold til den tidligere version. Denne protokol vil give forskerne de celler, der er nødvendige for at studere menneskelige lidelser, der påvirker det autonome nervesystem.
Introduction
Postganglionic sympatiske neuroner (symNs) hører til det autonome nervesystem (ANS) og har flere vigtige roller i at reagere og regulere homøostase i kroppen uafhængigt af bevidsthed. For eksempel stimulerer stress symNs og fremkalder kampen-eller-flugt reaktion, der fører til en stigning i puls, blodtryk, og svedtendens. SymNs er påvirket i flere menneskelige lidelser på grund af genetik, toksicitet / skade, eller som ledsagere til andre sygdomme. Et eksempel på en genetisk neuropati er børnesygdommen Familiær Dysautonomi (FD), hvor en alvorlig dysregulering af symNs forårsager dysautonomisk krise, tydeligt ved svedtendens, blotching af huden, opkastning sangreb, hypertension, og angst1. Et eksempel på toksicitet er kemoterapi behandling, som er blevet rapporteret at have toksiske bivirkninger på autonome neuroner2. Det er kendt, at autonome denervation og hyper-innervation både kan føre til, eller ledsage, sygdomme som Parkinsons sygdom eller hypertensive nyresygdom3,4. Således er det gavnligt for søgningen af nye og effektive behandlinger at være i stand til at forske og forstå mekanismerne i symNbiologi og defekter i forbindelse med sygdom.
Anatomi
Det perifere nervesystem grene i sensoriske og autonome divisioner. De afferente nerver i det sensoriske nervesystem er ansvarlige for følelse af smerte og berøring, mens ANS er ansvarlig for at formidle oplysninger fra alle organer til hjernen. ANS er opdelt i det enteriske nervesystem, innervating mave-tarmkanalen, det parasympatiske nervesystem, som er vigtigt for afslapning, og det sympatiske nervesystem (SNS), som er vigtigt for aktivering / regulering af organer. SNS tilpasser et to-neuron system5. Preganglionic sympatiske neurale axoner i rygmarven første projekt til den sympatiske ganglier, hvor postganglionic symN celle organer er placeret. Disse neuroner derefter sende lange fremskrivninger til innervate målet væv af hvert organ i kroppen. Signaler, der transmitteres af præganglioniske neuroner er kolinerge, mens postganglionic symNs er adrenerge og dermed udtrykke noradrenalin (NE) som deres vigtigste neurotransmitter. Der er få bemærkelsesværdige undtagelser fra postganglionic, sympatiske neuroner, der er kolinerge, herunder dem innervating blodkar. Adrenerge postganglioniske neuroner udtrykker enzymerne tyrosin hydroxylase (TH), aromatisk L-aminosyre decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroxylase (DBH) og monoaminoxidase (MAO-A), alle ansvarlige for at generere og metabolisere NE. Endvidere udtrykker de NE-genbrugstransportører og/eller receptorer α-adrenerge receptorer (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalintransporter (NET1) og vesikulær monoamintransportør (VMAT1/2).
Udvikling
Under embryonale udvikling symNs er afledt af neurale crest (NC), som opstår mellem neuralrørssystemet og overliggende ektoderm6, og kan differentiere i flere celle slægter, herunder melanocytter, osteoblaster, adipocytter, glia, enteriske neuroner, sensoriske neuroner, og autonome neuroner7. Neurale crest celler (NCC) er stærkt vandrende celler, der tager flere ruter gennem fosteret. På dette tidlige stadium af NC udvikling, cellerne udtrykke markører SNAIL1/2, FOXD3, og SOX108,9,10,11. Migrationsruten sammen med den aksiale placering, de vedtager, bestemmer den nc-undertype, som de vil udvikle sig i. Disse NC-undertyper kan skelnes ved deres specifikke HOX-genekspression: Kranie-NCC’er udtrykker ikke HOX-gener, vagus-NCC’er udtrykker HOX 1-5, trunk-NCC’er udtrykker HOX 6-9, og sakrale NCC’er udtrykker HOX 10-1112. Blandt dem, trunk NCC’er er anerkendt som den vigtigste kilde til symNs. SymN prækursorer udtrykke transskription faktor MASH1/ASCL113, som fremmer udtryk for PHOX2B14 og INSM115. GATA familie af transskription faktorer kommer til udtryk i slutningen af sympatisk udvikling. GATA2 og GATA3 udtrykkes i symNs, som igen aktiverer DBH16. Transskriptionsfaktoren HAND2 er også vigtig for dbh’ens og TH17’sudtryk og vedligeholdelse .
HPSCs (f.eks embryonale og inducerede pluripotente stamceller) er et kraftfuldt værktøj18 til at opsummere udviklingsmæssige paradigmer og generere symNs, der derefter kan anvendes til sygdommodellering af forskellige menneskelige lidelser. Samtidig med at der genereres symNs fra hPSCs, er det derfor afgørende at følge udviklingsretningslinjerne og vurdere udtryk for passende markører langs differentieringsprocessen.
Forrige symN-protokol
Kun få forskergrupper har tidligere rapporteret om generering af symNs fra HPSCs19,20,21. Den direkte sammenligning af disse protokoller til hinanden og vores blev gennemgået for nylig22. I 201623offentliggjorde vi en differentieringsprotokol for generering af autonome neuroner med symN-karakter (Figur 1A). Denne protokol anvendte KSR-baseret medium, som blev brugt til både vedligeholdelse af udifferentierede HPSC’er og celledifferentiering. Desuden blev hPSCs opretholdt på mus embryonale fibroblaster (MEF feeder celler). Vi anvendte denne protokol og KPC’er fra patienter med FD til at modellere lidelsen23. I 2019 beskrev vi en mere detaljeret version af denne ældre protokol24. Sammenfattende blev den neurale skæbne induceret af dobbelt SMAD-hæmning25 for at blokere TGF-β og BMP-signalering i de første 2 dage. WNT aktivering ved hjælp af CHIR99021 fremmes neurale sformere til at blive NC celler. På dag 11 blev cellerne sorteret efter FACS for CD49D+ eller SOX10+ populationer26,23, hvilket gav omkring 40% NC generation effektivitet. Sortering var således nødvendig for at sikre effektivitet og renhed for de næste trin i differentieringen. NCC’erne blev opretholdt og forstærket som sfæroider med kombineret behandling af FGF2 og CHIR. Efter 4 dage blev NC sfæroider af vedligeholdelse belagt og givet BDNF, GDNF, og NGF at afslutte symN modning. Selv om disse symNs udtrykt stærke symN markører såsom ASCL1, TH, DBH, og PHOX2A, markører for mere modne symNs, herunder udtryk for den nicotiniske acetylcholin receptor (CHRNA3/CHRNB4) og vesikel transportør (VMAT1/2), var lav, selv efter 70 dages differentiering. HOX gener i denne protokol blev ikke formelt testet, og modne neurale egenskaber, herunder elektrofysiologisk aktivitet af cellerne, blev ikke verificeret.
Her præsenterer vi en optimeret protokol til at generere symNs (Figur 1B). HPSC’er vedligeholdes under foderautomatfrie forhold på vitronectin (VTN)-belagte retter ved hjælp af Essential 8 (E8) media27. Formlen for differentieringsmediet er blevet ændret på hvert trin, hvorved procentdelen af NC’s befolkninger steget 28. Den symN modning kan gøres på CD49D+/ SOX10+ sorteret eller usorteret bulk NCC populationer. Begge viser høje niveauer af symN markør udtryk ved dag 30. Desuden er symNs genereret med denne protokol reagerer på elektrofysiologisk optagelse og til behandlinger med symN aktivator og inhibitor forbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har for nylig offentliggjort to anmeldelser, en diskuterer brugen af hPSC-afledte symNs for sygdom modellering31 samt en dybtgående sammenligning af tilgængelige differentiering protokoller22. Således, her fokuserer vi på fejlfinding den nuværende protokol for at hjælpe den interesserede forsker lykkes at gøre symNs. Under hele differentieringsprocessen bør kontaminering i alle faser kontrolleres nøje for at opnå ensartede data samt sunde differentierede celler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Heidi Ulrichs for kritisk læsning og redigering af manuskriptet.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Biologia do Desenvolvimento. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
