Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.
Abstract
Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.
Introduction
Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautonome Krise verursacht, die durch Schwitzen, Ausblasen der Haut, Erbrechen, Bluthochdruck und Angst1offensichtlich wird. Ein Beispiel für Toxizität ist die Chemotherapie, die toxische Nebenwirkungen auf autonome2Neuronen 2 haben soll. Es ist bekannt, dass autonome Denervation und Hyper-Innervation sowohl zu Krankheiten wie Parkinson oder hypertensiveNierenerkrankung,4führen können, als auch zu begleiten. Daher ist es für die Suche nach neuartigen und wirksamen Behandlungen von Vorteil, die Mechanismen der SymN-Biologie und Defekte im Zusammenhang mit Krankheiten zu erforschen und zu verstehen.
Anatomie
Das periphere Nervensystem verzweigt sich in sensorische und autonome Divisionen. Die affevollen Nerven des sensorischen Nervensystems sind für das Gefühl von Schmerz und Berührung verantwortlich, während das ANS für die Weitergabe von Informationen von allen Organen an das Gehirn verantwortlich ist. Das ANS ist in das enterische Nervensystem unterteilt, das den Magen-Darm-Trakt, das parasympathische Nervensystem, das für die Entspannung wichtig ist, und das sympathische Nervensystem (SNS), das für die Aktivierung/Regulierung von Organen wichtig ist. Das SNS passt ein Zwei-Neuron-System5an. Präganglionische sympathische neuronale Axone im Rückenmark projizieren zunächst auf die sympathischen Ganglien, wo sich postganglionische SymN-Zellkörper befinden. Diese Neuronen senden dann lange Projektionen, um das Zielgewebe jedes Organs im Körper zu innervieren. Signale, die von präganglionischen Neuronen übertragen werden, sind cholinerge, während postganglionische SymNs adrenerge sind und somit Noradrenalin (NE) als ihren wichtigsten Neurotransmitter ausdrücken. Es gibt nur wenige bemerkenswerte Ausnahmen von postganglionischen, sympathischen Neuronen, die cholinergisch sind, einschließlich derer, die die Blutgefäße innervierend bilden. Adrenergetische postganglonische Neuronen drücken die Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AAAD), Dopamin-Hydroxylase (DBH) und Monoaminoxidase (MAO-A) aus, die alle für die Erzeugung und Metabolisierung von NE verantwortlich sind. Darüber hinaus exprimieren sie die NE-Recycling-Transporter und/oder Rezeptoren a-adrenergen Rezeptor (ADRA2), den adrenergen Rezeptor (ADR2B), den Noradrenalin-Transporter (NET1) und den vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT1/2).
Entwicklung
Während der embryonalen Entwicklung werden SymNs aus dem Neuralkamm (NC) abgeleitet, der zwischen dem Neuralrohr und dem überlagernden Ektoderm6entsteht und sich in mehrere Zelllinien differenzieren kann, einschließlich Melanozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Glia, enterischen Neuronen, sensorischen Neuronen und autonomen Neuronen7. Neurale Kammzellen (NCCs) sind hochwandernde Zellen, die mehrere Wege durch den Embryo nehmen. In diesem frühen Stadium der NC-Entwicklung exprimieren die Zellen die Marker SNAIL1’2, FOXD3 und SOX108,9,10,11. Die Migrationsroute zusammen mit der axialen Position, die sie annehmen, bestimmt den NC-Subtyp, zu dem sie sich entwickeln werden. Diese NC-Subtypen lassen sich durch ihre spezifische HOX-Genexpression unterscheiden: Cranial NCCs exprimieren keine HOX-Gene, vagal-NCCs drücken HOX 1–5 aus, Trunk-NCCs drücken HOX 6–9 aus und sakrale NCCs drücken HOX 10–1112aus. Unter ihnen werden Trunk-NCCs als Hauptquelle von SymNs anerkannt. SymN-Vorläufer drücken den Transkriptionsfaktor MASH1/ASCL113aus, der die Expression von PHOX2B14 und INSM115fördert. Die GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren kommt während der späten sympathischen Entwicklung zum Ausdruck. GATA2 und GATA3 werden in den SymNs ausgedrückt, was wiederum DBH16aktiviert. Der Transkriptionsfaktor HAND2 ist auch wichtig für die Expression und Wartung von DBH und TH17.
HPSCs (z. B. embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen) sind ein leistungsfähiges Werkzeug18, um Entwicklungsparadigmen zu rekapitulieren und SymNs zu erzeugen, die dann zur Krankheitsmodellierung verschiedener menschlicher Störungen eingesetzt werden können. Daher ist es bei der Generierung von SymNs aus hPSCs von entscheidender Bedeutung, Entwicklungsrichtlinien zu befolgen und die Ausprägung geeigneter Marker entlang des Differenzierungsprozesses zu bewerten.
Vorheriges symN-Protokoll
Nur wenige Forschungsgruppen haben bisher über die Generierung von SymNs aus hPSCs19,20,21berichtet. Der direkte Vergleich dieser Protokolle untereinander und unserer wurde vor kurzem22überprüft. Im Jahr 201623haben wir ein Differenzierungsprotokoll für die Erzeugung autonomer Neuronen mit SymN-Charakter veröffentlicht (Abbildung 1A). Dieses Protokoll verwendete KSR-basiertes Medium, das sowohl bei der Aufrechterhaltung undifferenzierter hPSCs als auch bei der Zelldifferenzierung verwendet wurde. Darüber hinaus wurden hPSCs auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF-Feederzellen) aufrechterhalten. Wir verwendeten dieses Protokoll und PSCs von Patienten mit FD, um die Störung23zu modellieren. Im Jahr 2019 haben wir eine detailliertere Version dieses älteren Protokolls24beschrieben. Zusammenfassend wurde das neuronale Schicksal durch die doppelte SMAD-Hemmung25 induziert, um die TGF– und BMP-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu blockieren. Die WNT-Aktivierung mit CHIR99021 förderte neuronale Vorläufer zu NC-Zellen. Am 11. Tag wurden die Zellen nach FACS für CD49D+ oder SOX10+ Populationen26,23sortiert, was zu einer Effizienz von etwa 40 % NC-Erzeugung führte. Daher war eine Sortierung erforderlich, um die Effizienz und Reinheit für die nächsten Differenzierungsschritte zu gewährleisten. Die NCCs wurden mit der kombinierten Behandlung von FGF2 und CHIR als Sphäroide aufrechterhalten und verstärkt. Nach 4 Tagen wurden die NC-Sphäroide der Wartung plattiert und mit BDNF, GDNF und NGF versorgt, um die SymN-Reifung zu beenden. Obwohl diese SymNs starke SymN-Marker wie ASCL1, TH, DBH und PHOX2A exprimierten, waren Marker für reifere SymNs, einschließlich der Expression des Nicotinacetylcholin-Rezeptors (CHRNA3/CHRNB4) und des Vesikeltransporters (VMAT1/2), auch nach 70 Tagen Differenzierung niedrig. HOX-Gene in diesem Protokoll wurden nicht formal getestet, und reife neuronale Eigenschaften, einschließlich der elektrophysiologischen Aktivität der Zellen, wurden nicht überprüft.
Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SymNs vor (Abbildung 1B). HPSCs werden unter feederfreien Bedingungen auf vitronectin (VTN)-beschichteten Gerichten mit Essential 8 (E8) Medien27gehalten. Die Formel der Differenzierungsmedien wurde in jeder Phase geändert, wodurch der Prozentsatz der NC-Bevölkerungum 28erhöht wurde. Die SymN-Reifung kann auf CD49D+/SOX10+ sortierten oder unsortierten Massen-NCC-Populationen durchgeführt werden. Beide zeigen eine hohe SymN-Marker-Expression am 30. Tag. Darüber hinaus reagieren die mit diesem Protokoll erzeugten SymNs auf elektrophysiologische Aufzeichnungen und Auflagen mit SymN-Aktivator- und Inhibitorverbindungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
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