יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.
Abstract
תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) הפכו כלי רב עצמה למידול מחלות ולחקר התפתחות עובריים אנושית בתחום החוץ. בעבר הצגנו פרוטוקול בידול לנגזרת של נוירונים אוטונומית עם אופי סימפטי שהוחל על חולים עם נוירופתיה אוטונומית. עם זאת, הפרוטוקול נבנה על החלפת סרום החוצה (KSR) ומאכיל מבוססי תנאי התרבות, ועל מנת להבטיח יעילות גבוהה בידול, מיון התא היה הכרחי. גורמים אלה גורמים לשונות גבוהה, עלות גבוהה והשתנות נמוכה. יתרה מזאת, תכונות סימפטיות בוגרות, כולל פעילות חשמלית, לא אומתו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב שבו תרבות PSC ובידול מתבצעים בתנאי תרבות המוגדרים ללא מאכיל וכימית. סמנים גנטיים מזהים את ציצה. העצבים העצבית מזוהים בידול נוסף לתוך הנוירונים הסימפתטית הפוסט מושגת לאחר 20 ימים ללא צורך מיון התא. הקלטה אלקטרופיסיולוגית מראה. את זהות הנוירונים התפקודית הירי זוהה מן הנוירונים שלנו הבדיל יכול להיות משופר על ידי ניקוטין מדוכאים על ידי היריב קולטן אדרפרוכולינרגיות propranolol. ושלתי עצבי ביניים אוהדים בפרוטוקול זה ניתן לשמור כספרואידים עצביים עד 2 שבועות, אשר מאפשר הרחבה של התרבויות. בסכום, הפרוטוקול המעודכן שלנו הבחנה הקוד מראה יעילות גבוהה בידול, מיותר להתגלות, גמישות יותר, והתבגרות עצבית טובה יותר לעומת הגירסה הקודמת. פרוטוקול זה יספק לחוקרים את התאים הנחוצים לחקר הפרעות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים האוטונומית.
Introduction
הנוירונים הסימפוניים הסימפתטית (סימטריות) שייכים למערכת העצבים האוטונומית (ANS) ויש להם תפקידים חשובים מרובים בתגובה ויסות הומאוסטזיס של הגוף ללא תלות של התודעה. לדוגמה, המתח מעורר סימטריות ומעורר את תגובת הקרב או הטיסה שמובילה לעלייה בקצב הלב, לחץ דם והזעה. סימטריות מושפעים בהפרעות אנושיות מרובות בשל גנטיקה, רעילות/פציעה, או כמו לוויה למחלות אחרות. דוגמה של נוירופתיה גנטית היא הפרעת ילדות Dysautonomia (FD), שם חוסר התקנה חמורה של סימטריות גורמת משבר dysautonomia, ברור על ידי הזעה, blotching של העור, הקאות התקפות, יתר לחץ דם, וחרדה1. דוגמה של רעילות היא טיפול כימותרפיה, אשר דווחה יש תופעות לוואי רעילות על נוירונים אוטונומית2. ידוע כי הדבציה אוטונומית ו-hyper-אינבציה יכול להוביל, או ללוות, מחלות כגון מחלת פרקינסון או מחלת כליות יתר לחץ דם3,4. לפיכך, היכולת לערוך מחקר ולהבין את המנגנונים של הביולוגיה הסימטרית ופגמים בהקשר של מחלות, מועילים לחיפוש אחר טיפולים חדשניים ויעילים.
אנטומיה
מערכת העצבים ההיקפית מסתעף לחטיבות חושיות ואוטונומיות. עצבי הגוף של מערכת העצבים החושית אחראים לתחושת הכאב והמגע, ואילו ה-ANS אחראי לממסר מידע מכל האברים למוח. ה-ANS מחולק למערכת העצבים המעית, מinnervating במערכת העיכול, מערכת העצבים הפאראסימפתטית, החשובה להרפיה ומערכת העצבים הסימפתטית (SNS), החשובה להפעלה/לוויסות איברים. מערכת ההגירה מתאימה. למערכת דו-תא5 האקסון העצבי הסימפתטית מקדם בחוט השדרה הראשון בעמוד השידרה לגנגוליה הסימפתטית, שם ממוקמות הגופים הסלולאריים של תאי הדואר הנכנס. נוירונים אלה ולאחר מכן לשלוח התחזיות הארוכות כדי לinnervate את רקמות היעד של כל איבר בגוף. אותות ששודרו על ידי נוירונים טרום-הפרה הם cholinergic, ואילו הסימטרי הפוסט הם אדרלירגיות ובכך לבטא נוראדרנלין (NE) כמו מוליך עצבי הראשי שלהם. ישנם מספר חריגים בולטים של postganglionic, הנוירונים הסימפוניים כי הם cholinergic, כולל אלה innervating כלי הדם. הנוירונים באנגנגלייונים מביעים את אנזימי טירולך הידרוקסילז (TH), חומצה אמינית לחומצות אמינו (AAAD), דופמין β-הידרוקסילז (DBH), ומונואמין אוקסידאז (מאו-א), האחראים להפקת ולחילוף חומרים NE. יתר על כן, הם מבטאים את הטרנספורטי מיחזור מחזור ו/או קולטני α-אדרארדירגיות קולטן (ADRA2), β-אדרארדירגיות קולטן (ADR2B), נוראדרנלין טרנספורטר (NET1), ו-והמשלח מונואמין (VMAT1/2).
פיתוח
במהלך התפתחות מעובריים מופק הרכס העצבי (NC), אשר עולה בין הצינור העצבי והנחת העור העליון6, והוא יכול להבדיל לתוך שורה של תאים מרובים, כולל מלנוציטים, אוסטאופתית, adipocytes, גליה, נוירונים בידור, נוירונים חושים, ונוירונים אוטונומית7. התאים ציצה עצבית (NCCs ‘) הם תאים נודדים מאוד כי לנקוט מספר נתיבים דרך העובר. בשלב זה מוקדם של התפתחות NC, התאים לבטא את סמנים SNAIL1/2, FOXD3, ו SOX108,9,10,11. תוואי ההעברה יחד עם מיקום הציר שהם מאמצים קובע את תת-הסוג של NC שאליו הם יתפתחו. אלה תת-סוגי NC יכול להיות מכובד על ידי הביטוי הספציפי שלהם hox גנים: nccs הגולגולת לא לבטא גנים hox, אגל nccs ק express hox 1 – 5, טרונק nccs ק express hox 6-9, ו-nccs ‘ ו-n-לבטא hox 10 – 1112. ביניהם, NCCs טרונק מזוהים כמקור העיקרי של סימטריות. סימון מקדים מבטא את גורם התמלול MASH1/ASCL113, אשר מקדם את הביטוי של PHOX2B14 ו INSM115. משפחת טה של גורמי התמלול באה לידי ביטוי במהלך התפתחות אוהדת מאוחרת. GATA2 ו GATA3 מבוטאים באופן סימטרי, אשר בתורו מפעיל DBH16. התמלול גורם HAND2 חשוב גם לביטוי ותחזוקה של DBH ו-TH17.
HPSCs (למשל, עובריים והמושרה מושרה בתאי גזע) הם כלי רב עוצמה18 כדי תבניות התפתחותיות לכידה וליצור סימטריות כי ניתן לאחר מכן להיות מועסק עבור דוגמנות המחלה של הפרעות אנושיות שונות. כך, תוך יצירת סימטריות מ hPSCs, זה חיוני לעקוב אחר הנחיות התפתחותיות להעריך את הביטוי של סמנים המתאימים לאורך תהליך הבידול.
פרוטוקול סימטרי קודם
מספר קבוצות מחקר דיווחו בעבר על הדור של סימטריות מ hPSCs19,20,21. ההשוואה הישירה של הפרוטוקולים האלה אחד לשני ושלנו נבדקה לאחרונה22. בשנת2016,פרסמנו פרוטוקול בידול לדור הנוירונים האוטונומית עם תו סימטרי (איור 1a). פרוטוקול זה השתמש במדיום מבוסס KSR, ששימש הן בתחזוקת hPSCs מובחן ובידול התא. יתר על כן, hPSCs היו שמרו על העכבר מעובריים מתחלקים (ממזין MEF תאים). אנו המועסקים בפרוטוקול זה ו PSCs מחולים עם FD כדי לדגמן את ההפרעה23. בשנת 2019, תיארנו גרסה מפורטת יותר של הפרוטוקול הישן הזה24. לסיכום, הגורל העצבי המושרה על ידי עיכוב SMAD כפול25 לחסום tgf-β ו-BMP איתות ב 2 הימים הראשונים. הפעלת WNT באמצעות CHIR99021 ושלתי העצבית הקודמת להפוך לתאי NC. ביום 11, התאים היו ממוינים על ידי facs עבור CD49D+ או SOX10+ אוכלוסיות26,23, אשר הניב כ 40% NC הדור יעילות. לפיכך, היה צורך במיון כדי להבטיח את היעילות והטוהר לשלבים הבאים של בידול. ה-NCCs ‘ היו מתוחזקים ומוחזקים כספרואידים עם הטיפול המשולב של FGF2 ו-CHIR. לאחר 4 ימים, spheroids NC של תחזוקה היו מצופים וניתנה BDNF, GDNF, ו NGF לסיים את ההבשלה סימטרי. למרות הסימטריות הללו הביע סמנים הסימטרי החזקים כגון ASCL1, TH, dbh, ו PHOX2A, סמנים עבור סימטריות בוגרת יותר, כולל ביטוי של קולטן אצטילכולין ניקטימית (CHRNA3/CHRNB4) ו-שלפוחית טרנספורטר (VMAT1/2), היו נמוכים גם לאחר 70 ימים של בידול. גנים HOX בפרוטוקול זה לא נבדקו רשמית, ותכונות עצביות בוגרת, כולל פעילות אלקטרופיזיולוגית של התאים, לא אומתו.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב ליצירת סימטריות (איור 1B). HPSCs נשמרים בתנאים ללא מאכיל, ב vitronectin (VTN) מנות מצופות, באמצעות Essential 8 (E8) מדיה27. הנוסחה של מדיית הבידול השתנתה בכל שלב ובכך מגבירה את אחוז האוכלוסיה ב-NC28. את ההבשלה הסימטרי ניתן לעשות על CD49D+/Sox10+ מיון או ממוין אוכלוסייה ncc בצובר. שניהם מציגים רמות גבוהות של ביטוי סמן ביום 30. יתר על כן, הסימפנים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מגיבים להקלטה אלקטרופיזיולוגית ולטיפולים עם סימטריות activator ותרכובות מעכבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרסמנו לאחרונה שתי חוות דעת, אחד דן בשימוש ב-hPSC-הנגזרות של המחלה עבור מידול מחלות31 , כמו גם השוואה מעמיקה של פרוטוקולי בידול זמין22. כך, כאן אנו מתמקדים בפתרון בעיות הפרוטוקול הנוכחי כדי לעזור חוקר המעוניינים להצליח לעשות סימטריות. במהלך כל תהליך הבידול, על מנת לצבו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות להיידי אולריצ’ס על קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Biologia do Desenvolvimento. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
