Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas
Summary
Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.
Abstract
As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tornaram-se uma poderosa ferramenta para a modelagem de doenças e o estudo do desenvolvimento embrionário humano in vitro. Anteriormente, apresentamos um protocolo de diferenciação para a derivação de neurônios autônomos com caráter simpático que tem sido aplicado a pacientes com neuropatia autônoma. No entanto, o protocolo foi construído sobre a Substituição de Soro Knock Out (KSR) e as condições de cultura baseadas em alimentadores, e para garantir alta eficiência de diferenciação, a classificação celular era necessária. Esses fatores causam alta variabilidade, alto custo e baixa reprodutibilidade. Além disso, não foram verificadas propriedades simpáticas maduras, incluindo a atividade elétrica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado onde a cultura e a diferenciação do PSC são realizadas em condições culturais livres de alimentadores e quimicamente definidas. Marcadores genéticos que identificam a crista neural do tronco são identificados. Outra diferenciação em neurônios simpáticos pós-ganglionários é alcançada após 20 dias sem a necessidade de classificação celular. A gravação eletrofisiológica mostra ainda a identidade funcional do neurônio. O disparo detectado a partir de nossos neurônios diferenciados pode ser aprimorado pela nicotina e suprimido pelo antagonista do receptor adrenérgico propranolol. Progenitores neurais simpáticos intermediários neste protocolo podem ser mantidos como esferóides neurais por até 2 semanas, o que permite a expansão das culturas. Em suma, nosso protocolo de diferenciação de neurônios simpáticos atualizados mostra alta eficiência de diferenciação, melhor reprodutibilidade, mais flexibilidade e melhor maturação neural em comparação com a versão anterior. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores as células necessárias para estudar os distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso autônomo.
Introduction
Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade1. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos2. Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.
Anatomia
O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios5. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).
Desenvolvimento
Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição6, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos7. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-1112. Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL113, que promove a expressão de PHOX2B14 e INSM115. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH16. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th17.
Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta18 para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.
Protocolo symN anterior
Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente22. Em 201623, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno23. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo24. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD25 para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D+ ou SOX10+ 26,23, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)27. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc28. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D+/SOX10+ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Publicamos recentemente duas revisões, uma discutindo o uso de symNs derivados do hPSC para modelagem de doenças31, bem como uma comparação aprofundada dos protocolos de diferenciação disponíveis22. Assim, aqui nos concentramos em solucionar problemas do protocolo atual para ajudar o pesquisador interessado a ter sucesso na fabricação de symNs. Durante todo o processo de diferenciação, a fim de obter dados consistentes, bem como células diferenciadas saudáveis,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Heidi Ulrichs pela leitura crítica e edição do manuscrito.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
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