Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden
Summary
In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn uitgegroeid tot een krachtig instrument voor ziekte modellering en de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling in vitro. We presenteerden eerder een differentiatieprotocol voor de afleiding van autonome neuronen met sympathiek karakter dat is toegepast op patiënten met autonome neuropathie. Het protocol werd echter gebouwd op Knock Out Serum Replacement (KSR) en op feeder gebaseerde cultuuromstandigheden, en om een hoge differentiatie-efficiëntie te garanderen, was celsortering noodzakelijk. Deze factoren veroorzaken een hoge variabiliteit, hoge kosten en een lage reproduceerbaarheid. Bovendien zijn volwassen sympathieke eigenschappen, waaronder elektrische activiteit, niet geverifieerd. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarbij PSC-cultuur en differentiatie worden uitgevoerd in feedervrije en chemisch gedefinieerde cultuuromstandigheden. Genetische markers die hoofdwapen identificeren, worden geïdentificeerd. Verdere differentiatie in postganglionic sympathieke neuronen wordt bereikt na 20 dagen zonder de noodzaak voor celsortering. Elektrofysiologische opname toont verder de functionele neuron identiteit. Afvuren gedetecteerd van onze gedifferentieerde neuronen kan worden versterkt door nicotine en onderdrukt door de adrenerge receptor antagonist propranolol. Intermediaire sympathische neurale voorouders in dit protocol kunnen tot 2 weken worden gehandhaafd als neurale sferoïden, waardoor de culturen kunnen worden uitgebreid. Kortom, onze bijgewerkte sympathische neuron differentiatie protocol toont een hoge differentiatie efficiëntie, betere reproduceerbaarheid, meer flexibiliteit, en een betere neurale rijping in vergelijking met de vorige versie. Dit protocol zal onderzoekers voorzien van de cellen die nodig zijn om menselijke aandoeningen te bestuderen die het autonome zenuwstelsel beïnvloeden.
Introduction
Postganglionic sympathische neuronen (symNs) behoren tot het autonome zenuwstelsel (ANS) en hebben meerdere belangrijke rollen in het reageren en reguleren van homeostase van het lichaam onafhankelijk van bewustzijn. Stress stimuleert bijvoorbeeld symnen en roept de vecht-of-vluchtrespons op die leidt tot een toename van hartslag, bloeddruk en zweten. Symns worden beïnvloed in veelvoudige menselijke wanorde toe te schrijven aan genetica, giftigheid/verwonding, of als metgezellen aan andere ziekten. Een voorbeeld van een genetische neuropathie is de kinderziekte Familiale Dysautonomia (FD), waar een ernstige dysregulatie van symns dysautonome crisis veroorzaakt, duidelijk door zweten, vlekken van de huid, braken aanvallen, hypertensie, en angst1. Een voorbeeld van toxiciteit is chemotherapie behandeling, waarvan is gemeld dat toxische bijwerkingen hebben op autonome neuronen2. Het is bekend dat autonome denerhonger en hyper-innervatie beide kunnen leiden tot, of begeleiden, ziekten zoals de ziekte van Parkinson of hypertensieve nierziekte3,4. Dus, in staat zijn om onderzoek te doen en de mechanismen van symN biologie en gebreken in de context van de ziekte te begrijpen is gunstig voor het zoeken naar nieuwe en effectieve behandelingen.
Anatomie
Het perifere zenuwstelsel vertakt zich in zintuiglijke en autonome divisies. De afferente zenuwen van het zintuiglijke zenuwstelsel zijn verantwoordelijk voor het gevoel van pijn en aanraking, terwijl de ANS verantwoordelijk is voor het doorgeven van informatie van alle organen naar de hersenen. Het ANS is verdeeld in het enterische zenuwstelsel, waarbij het maag-darmkanaal, het parasympathische zenuwstelsel, dat belangrijk is voor ontspanning, en het sympathische zenuwstelsel (SNS), dat belangrijk is voor activering/regulatie van organen. De SNS past een twee-neuron systeem5. Preganglionic sympathische neurale axonen in het ruggenmerg eerste project aan de sympathische ganglia, waar postganglionic symN cel lichamen bevinden. Deze neuronen sturen dan lange projecties om de doelweefsels van elk orgaan in het lichaam innervate. Signalen overgedragen door preganglionic neuronen zijn cholinerge, terwijl postganglionic symNs zijn adrenergic en dus express noradrenaline (NE) als hun belangrijkste neurotransmitter. Er zijn enkele opmerkelijke uitzonderingen van postganglionic, sympathische neuronen die cholinerg zijn, met inbegrip van degenen innervating bloedvaten. Adrenerge postganglionic neuronen uitdrukken de enzymen tyrosine hydroxylase (TH), aromatische L-aminozuur decarboxylase (AAAD), dopamine β-hydroxylase (DBH), en monoamine oxidase (MAO-A), allemaal verantwoordelijk voor het genereren en metaboliseren NE. Voorts drukken zij de NE-recyclingtransporters en/of receptoren α-adrenerge receptor (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalinetransporter (NET1) en vesiculaire monoaminetransporter (VMAT1/2) uit.
Ontwikkeling
Tijdens de embryonale ontwikkeling symNs zijn afgeleid van de neurale crest (NC), die ontstaat tussen de neurale buis en overlaying ectoderm6, en kan zich onderscheiden in meerdere celgeslachten, met inbegrip van melanocyten, osteoblasten, adipocyten, glia, enterische neuronen, sensorische neuronen, en autonome neuronen7. Neurale crest cellen (NPC’s) zijn zeer migrerende cellen die verschillende routes door het embryo. In dit vroege stadium van nc-ontwikkeling drukken de cellen de markers SNAIL1/2, FOXD3 en SOX108,9,10,11uit . De migratieroute bepaalt samen met de axiale locatie die ze aannemen het NC-subtype waarin ze zich zullen ontwikkelen. Deze NC-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun specifieke HOX-genexpressie: CranialN NPC’s drukken geen HOX-genen uit, vagalNcc’s express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9 en sacrale NPC’s express HOX 10–1112. Onder hen, stam NPC’s worden erkend als de belangrijkste bron van symNen. SymN precursoren uiten de transcriptiefactor MASH1/ASCL113, die de expressie van PHOX2B14 en INSM115bevordert . De GATA familie van transcriptie factoren wordt uitgedrukt tijdens de late sympathische ontwikkeling. GATA2 en GATA3 worden uitgedrukt in de symNs, die op hun beurt activeert DBH16. De transcriptiefactor HAND2 is ook belangrijk voor de expressie en het onderhoud van DBH en TH17.
HPSCs (bijvoorbeeld embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) zijn een krachtig instrument18 om ontwikkelingsparadigma’s te recapituleren en symNs te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering van verschillende menselijke aandoeningen. Het genereren van symnen uit hPSCs is dus van cruciaal belang om ontwikkelingsrichtlijnen te volgen en de expressie van geschikte markeringen langs het differentiatieproces te beoordelen.
Vorig symN-protocol
Weinig onderzoeksgroepen hebben eerder gemeld de generatie van symN’s van hPSCs19,20,21. De directe vergelijking van deze protocollen met elkaar en de onze werd onlangs herzien22. In 201623, publiceerden we een differentiatie protocol voor het genereren van autonome neuronen met symN karakter (Figuur 1A). Dit protocol gebruikte KSR-gebaseerd medium, dat werd gebruikt bij zowel het onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs als celdifferentiatie. Bovendien werden hPSC’s gehandhaafd op embryonale fibroblasten van muizen (MEF-feedercellen). We gebruikten dit protocol en PSC’s van patiënten met FD om de aandoening 23 temodelleren. In 2019 beschreven we een meer gedetailleerde versie van dit oudere protocol24. Samengevat werd het neurale lot veroorzaakt door dubbele SMAD-remming25 om TGF-β en BMP-signalering in de eerste 2 dagen te blokkeren. WNT activering met chir99021 bevorderd neurale voorlopers om NC-cellen te worden. Op dag 11 werden cellen gesorteerd door FACS voor CD49D+ of SOX10+ populaties26,23, wat ongeveer 40% NC-generatie efficiëntie opleverde. Zo was sorteren nodig om de efficiëntie en zuiverheid voor de volgende stappen van differentiatie te waarborgen. De NPC’s werden gehandhaafd en versterkt als sferoïden met de gecombineerde behandeling van FGF2 en CHIR. Na 4 dagen werden de NC sferoïden van onderhoud verguld en kregen BDNF, GDNF en NGF de symN rijping te voltooien. Hoewel deze symN’s sterke symN-markers zoals ASCL1, TH, DBH en PHOX2A uitten, waren markers voor meer volwassen symnen, inclusief expressie van de nicotinische acetylcholine-receptor (CHRNA3/CHRNB4) en blaastransporter (VMAT1/2), laag, zelfs na 70 dagen differentiatie. HOX-genen in dit protocol werden niet formeel getest en volwassen neurale eigenschappen, waaronder elektrofysiologische activiteit van de cellen, werden niet geverifieerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van symNs (figuur 1B). HPSC’s worden onderhouden in feeder-vrije omstandigheden, op vitronectine (VTN)-gecoate gerechten, met behulp van Essential 8 (E8) media27. De formule van de differentiatiemedia is in elk stadium gewijzigd, waardoor het percentage van de NC-populatie28is verhoogd. De symN rijping kan worden gedaan op CD49D+/ SOX10+ gesorteerdof ongesorteerde bulk NCC populaties. Beide tonen hoge niveaus van symN marker expressie door dag 30. Bovendien reageren de symnen die met dit protocol worden gegenereerd, op elektrofysiologische opname en op behandelingen met symN-activator- en inhibitorverbindingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We publiceerden onlangs twee reviews, een bespreken van het gebruik van hPSC-afgeleide symNs voor ziekte modellering31 evenals een diepgaande vergelijking van de beschikbare differentiatie protocollen22. Dus, hier richten we ons op het oplossen van problemen met het huidige protocol om de geïnteresseerde onderzoeker te helpen slagen in het maken van symNs. Tijdens het gehele differentiatieproces, om consistente gegevens en gezonde gedifferentieerde cellen te verkrijgen, mo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Heidi Ulrichs bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Biologia do Desenvolvimento. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
