Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente
Summary
En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.
Abstract
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se han convertido en una poderosa herramienta para el modelado de enfermedades y el estudio del desarrollo embrionario humano in vitro. Anteriormente presentamos un protocolo de diferenciación para la derivación de neuronas autonómicas con carácter simpático que se ha aplicado a pacientes con neuropatía autonómica. Sin embargo, el protocolo se construyó sobre el reemplazo de suero Knock Out (KSR) y las condiciones de cultivo basadas en el alimentador, y para garantizar una alta eficiencia de diferenciación, la clasificación celular era necesaria. Estos factores causan alta variabilidad, alto costo y baja reproducibilidad. Además, no se han verificado las propiedades simpáticas maduras, incluida la actividad eléctrica. Aquí, presentamos un protocolo optimizado donde el cultivo y la diferenciación de PSC se realizan en condiciones de cultivo libres de alimentación y definidas químicamente. Se identifican marcadores genéticos que identifican la cresta neural del tronco. Una mayor diferenciación en las neuronas simpáticas postgangliónicas se logra después de 20 días sin la necesidad de clasificación celular. El registro electrofisiológico muestra aún más la identidad funcional de la neurona. El disparo detectado por nuestras neuronas diferenciadas puede ser mejorado por la nicotina y suprimido por el antagonista del receptor adrenérgico propranolol. Los progenitores neuronales simpáticos intermedios en este protocolo se pueden mantener como esferoides neuronales durante un máximo de 2 semanas, lo que permite la expansión de los cultivos. En resumen, nuestro protocolo actualizado de diferenciación de neuronas simpáticas muestra una alta eficiencia de diferenciación, mejor reproducibilidad, más flexibilidad y mejor maduración neuronal en comparación con la versión anterior. Este protocolo proporcionará a los investigadores las células necesarias para estudiar los trastornos humanos que afectan al sistema nervioso autónomo.
Introduction
Las neuronas simpáticas postgangliónicas (simron) pertenecen al sistema nervioso autónomo (ANS) y tienen múltiples papeles importantes en la respuesta y regulación de la homeostasis del cuerpo independiente de la conciencia. Por ejemplo, el estrés estimula las sin, y evoca la respuesta de lucha o vuelo que conduce a un aumento de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la sudoración. Los SymN se ven afectados en múltiples trastornos humanos debido a la genética, toxicidad/lesión, o como compañeros de otras enfermedades. Un ejemplo de neuropatía genética es el trastorno infantil Disautonomia Familiar (FD), donde una severa desregulación de las simadoras causa crisis disautonómica, evidente por sudoración, manchadeo de la piel, ataques de vómitos, hipertensión y ansiedad1. Un ejemplo de toxicidad es el tratamiento de quimioterapia, que se ha divulgado para tener efectos secundarios tóxicos en las neuronas autonómicas2. Se sabe que la denervación autonómica y la hiperinnervación pueden conducir o acompañar a enfermedades como la enfermedad de Parkinson o la enfermedad renal hipertensiva3,4. Por lo tanto, ser capaz de llevar a cabo investigaciones y comprender los mecanismos de la biología sinmN y defectos en el contexto de la enfermedad es beneficioso para la búsqueda de tratamientos novedosos y eficaces.
Anatomía
El sistema nervioso periférico se ramifica en divisiones sensoriales y autonómicas. Los nervios aferentes del sistema nervioso sensorial son responsables de la sensación de dolor y tacto, mientras que el ANS es responsable de transmitir información de todos los órganos al cerebro. El ANS se divide en el sistema nervioso entérico, inervando el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso parasimpático, que es importante para la relajación, y el sistema nervioso simpático (SNS), que es importante para la activación / regulación de los órganos. El SNS adapta un sistema de dos neuronas5. Los axones neurales simpáticos pregangliónicos en la médula espinal primero se proyectan a los ganglios simpáticos, donde se encuentran los cuerpos celulares simios posganglónicos. Estas neuronas entonces envían proyecciones largas para inervate los tejidos diana de cada órgano en el cuerpo. Las señales transmitidas por las neuronas pregangliónicas son colinérgicas, mientras que los símN postgangliónicos son adrenérgicos y por lo tanto expresan norepinefrina (NE) como su principal neurotransmisor. Hay pocas excepciones notables de las neuronas simpáticas postgangliónicas que son colinérgicas, incluyendo las que inervan los vasos sanguíneos. Las neuronas postgangliónicas adrenérenérgicas expresan las enzimas tirosina hidroxilasa (TH), la aromática L-aminoácido decarboxilasa (AAAD), la dopamina-hidroxilasa (DBH) y la monoaminooxidasa (MAO-A), todas responsables de generar y metabolizar NE. Además, expresan los transportadores de reciclaje NE y/o los receptores de receptores adrenérgicos (ADRA2), el receptor adrenérgico (ADR2B), el transportador de noradrenalina (NET1) y el transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).
Desarrollo
Durante el desarrollo embrionario, los sinmos se derivan de la cresta neural (NC), que emerge entre el tubo neural y la superposición de ectodermos6,y pueden diferenciarse en múltiples linajes celulares, incluyendo melanocitos, osteoblastos, adipocitos, glia, neuronas entéricas, neuronas sensoriales y neuronas autonómicas7. Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que toman varias rutas a través del embrión. En esta etapa temprana del desarrollo de NC, las células expresan los marcadores SNAIL1/2, FOXD3 y SOX108,,9,10,11. La ruta de migración junto con la ubicación axial que adoptan determina el subtipo NC en el que se desarrollarán. Estos subtipos NC se pueden distinguir por su expresión génica HOX específica: los NCC craneales no expresan genes HOX, los NCC vagales expresan HOX 1–5, los NCC troncales expresan HOX 6–9 y los NCC sacros expresan HOX 10–1112. Entre ellos, los NCC troncales se reconocen como la fuente principal de symNs. Los precursores de SymN expresan el factor de transcripción MASH1/ASCL113, que promueve la expresión de PHOX2B14 e INSM115. La familia GATA de factores de transcripción se expresa durante el desarrollo simpático tardío. GATA2 y GATA3 se expresan en los sinmN, que a su vez activa DBH16. El factor de transcripción HAND2 también es importante para la expresión y el mantenimiento de DBH y TH17.
Los HpSC (por ejemplo, células madre embrionarias e pluripotentes inducidas) son una poderosa herramienta18 para recapitular paradigmas de desarrollo y generar sinmN que luego se pueden emplear para el modelado de enfermedades de diversos trastornos humanos. Por lo tanto, al generar sinmos a partir de hPSCs, es crucial seguir las pautas de desarrollo y evaluar la expresión de marcadores apropiados a lo largo del proceso de diferenciación.
Protocolo SymN anterior
Pocos grupos de investigación han informado previamente de la generación de sinmN sde hPSCs19,20,21. La comparación directa de estos protocolos entre sí y el nuestro fue revisada recientemente22. En 201623,publicamos un protocolo de diferenciación para la generación de neuronas autonómicas con carácter symN(Figura 1A). Este protocolo utilizaba un medio basado en KSR, que se utilizaba tanto en el mantenimiento de hPSC indiferenciados como en la diferenciación celular. Además, se mantuvieron los hPSC en fibroblastos embrionarios de ratón (células alimentadoras de MEF). Empleamos este protocolo y PSCs de pacientes con FD para modelar el trastorno23. En 2019, describimos una versión más detallada de este protocolo anterior24. En resumen, el destino neural fue inducido por la inhibición SMAD dual25 para bloquear la señalización de TGF y BMP en los primeros 2 días. La activación de WNT mediante CHIR99021 promovió progenitores neuronales para convertirse en células NC. En el día 11, las células fueron ordenadas por FACS para CD49D+ o SOX10+ poblaciones26,23, que produjo aproximadamente 40% de eficiencia de generación NC. Por lo tanto, la clasificación era necesaria para garantizar la eficiencia y pureza para los próximos pasos de diferenciación. Los NCC se mantuvieron y se amplificaron como esferoides con el tratamiento combinado de FGF2 y CHIR. Después de 4 días, los esferoides NC de mantenimiento fueron chapados y recibieron BDNF, GDNF y NGF para terminar la maduración de la simN. Aunque estos sinmN expresaron marcadores sinmN fuertes como ASCL1, TH, DBH y PHOX2A, los marcadores para sinmNs más maduros, incluida la expresión del receptor de acetilcolina nicotínico (CHRNA3/CHRNB4) y el transportador de vesículas (VMAT1-2), eran bajos incluso después de 70 días de diferenciación. Los genes HOX en este protocolo no fueron probados formalmente, y las propiedades neuronales maduras, incluyendo la actividad electrofisiológica de las células, no fueron verificadas.
Aquí, presentamos un protocolo optimizado para generar symNs(Figura 1B). Los HPSC se mantienen en condiciones libres de alimentación, en platos recubiertos con vitronectina (VTN), utilizando los medios Essential 8 (E8)27. La fórmula de los medios de diferenciación se ha modificado en cada etapa, aumentando así el porcentaje de la población NC28. La maduración de la sinmN se puede hacer en CD49D+/SOX10+ poblaciones de NCC a granel ordenadas o no ordenadas. Ambos muestran altos niveles de expresión de marcador symN para el día 30. Además, los sinmN generados con este protocolo responden a la grabación electrofisiológica y a los tratamientos con activador de SIMn y compuestos inhibidores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recientemente publicamos dos reseñas, una discutiendo el uso de sínmNs derivados de hPSC para el modelado de enfermedades31, así como una comparación en profundidad de los protocolos de diferenciación disponibles22. Por lo tanto, aquí nos centramos en la solución de problemas del protocolo actual para ayudar al investigador interesado a tener éxito en la fabricación de symNs. Durante todo el proceso de diferenciación, con el fin de obtener datos consistentes, así…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Heidi Ulrichs por la lectura crítica y la edición del manuscrito.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
Referências
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