无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析
Summary
提出了一种对小麦粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该协议包括醋酸代谢物提取方法和反向相液色谱-质谱方法，在正负电喷雾电相成像模式下采集。
Abstract
了解基因、环境和农业实践中的管理之间的相互作用，可以更准确地预测和管理产品产量和质量。代谢组学数据提供了在给定时间时刻读取这些相互作用的信息，并且对生物体的生化状态信息。此外，代谢物的单个代谢物或面板可用作产量和质量预测和管理的精确生物标志物。据预测，植物美塔博洛米将包含数千种具有不同物理化学特性的小分子，为生物化学洞察生理特性和生物标志物发现提供了机会。为了利用这一点，代谢学研究人员的一个关键目标是在单个分析中捕获尽可能多的物理化学多样性。在这里，我们提出了一种基于液相色谱-质谱的非靶向代谢组学方法，用于分析田间生长的小麦颗粒。该方法使用液体色谱四元溶剂管理器引入第三个移动相，并将传统的反向相梯度与脂质梯度相结合。详细介绍了谷物制备、代谢物提取、工具分析和数据处理工作流程。观察了良好的质量精度和信号可重复性，该方法每电离模式产生约500个生物学相关特征。此外，还确定了小麦品种之间的代谢物和脂质特征信号显著不同。
Introduction
了解农业中基因、环境和管理实践之间的相互作用，可以更准确地预测和管理产品产量和质量。植物代谢物受基因组、环境（气候、降雨等）等因素的影响，在农业环境中，作物的管理方式（即肥料、杀菌剂等的应用）都受其影响。与基因组不同，甲目瘤受所有这些因素的影响，因此代谢组学数据在特定时间提供这些相互作用的生化指纹。基于代谢组学的研究通常有两个目标之一：第一，加深对生物体的生物化学的理解，并帮助解释与生理学相关的扰动（非生物或生物应激）的反应机制;第二，将生物标志物与正在研究中的扰动联系起来。在这两种情况下，拥有这种知识的结果都是一种更精确的管理策略，以实现提高产量和质量的目标。
据预测，植物美塔博洛米含有数千种具有不同物理化学性质的小分子。目前，没有代谢组学平台（主要是质谱和核磁共振光谱学）可以在单个分析中捕获整个甲胺。开发此类技术（样品制备、代谢物提取和分析），在单个分析运行中尽可能大地覆盖甲胺，是代谢学研究人员的主要目标。以前对小麦颗粒的无目标代谢组学分析将多个色谱分离和采集极性的数据和/或仪器相结合，以扩大甲目覆盖。然而，这需要为每个方式单独编制和获取样品。例如，Beleggia等人2为GC-MS的极性分析物分析，以及对非极性分析物的GC-MS分析，编制了一个派生样本。Das等人3使用GC和LC-MS方法提高分析覆盖率;然而，这种方法通常需要上述单独的样品准备以及两个独立的分析平台。以前使用GC-MS22、3、43,4和LC-MS33、55平台对小麦颗粒的分析为GC-MS产生了50至412（55个已识别）特征，409个用于GC-MS和LC-MS的组合，几千个用于LC-MS脂质分析5。通过将至少两种模式合并为一种分析，可以保持扩展的美表体覆盖率，从而增加生物解释的丰富性，同时节省时间和成本。
为了允许通过反向相色谱法有效地分离各种脂质，现代脂质学方法在洗脱溶剂6中通常使用高比例的异丙醇，为可能通过色谱学而无法解决的脂质类提供方便。为了进行有效的脂质分离，起始移动相在有机成分7中也比典型的反向相色谱方法高得多，后者考虑其他类别的分子。梯度开始时的高有机成分使得这些方法不太适合许多其他类分子。最值得注意的是，反向相液色谱法采用二元溶剂梯度，从大部分水性成分开始，随着色谱的洗脱强度增加，有机含量增加。为此，我们力求将两种方法结合起来，在单个分析中实现代谢物的脂质和非脂类的分离。
在这里，我们提出了一种使用第三个移动相的色谱法，并使用单个样品制备和一个分析柱实现结合传统的反向相和脂质组学的色谱法。我们采用了许多质量控制措施和数据过滤步骤，这些措施以前在主要临床代谢组学研究中实施过。这些方法有助于确定具有高技术可重复性和生物相关性的强健特性，并排除不符合这些标准的特征。例如，我们描述对池质样本8、QC校正9、数据过滤99、1010和缺失特征11的归记分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了一种基于LC-MS的无靶向代谢组学方法，用于小麦颗粒分析。该方法通过将第三个移动相引入反向相梯度，将四种采集模式（反向相位和脂质抗逆相与正负电离）合并为两种模式。该组合方法每电离极性产生约500个生物学相关特征，其中大约一半在小麦品种的强度上明显不同。不同小麦品种颗粒代谢物浓度的显著变化表明生物化学的变化，这可能与抗病性、耐应力性和其他对谷?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢西澳大利亚州总理的农业和食品奖学金计划（西澳大利亚州政府就业、旅游、科学和创新系）和总理研究员西蒙·库克教授（该中心数字农业、柯廷大学和默多克大学）。现场试验和谷物样品收集得到了西澳大利亚州政府区域版税计划的支持。我们感谢格兰特利·施泰纳和罗伯特·法兰西对现场审判的贡献。NCRIS资助的澳大利亚生物平台公司因设备融资而得到认可。
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referências
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