Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano
Summary
Viene presentato un metodo per l’analisi non mirata di metaboliti e lipidi di grano. Il protocollo include un metodo di estrazione dei metaboliti dell’acetonitricolo e la metodologia di cromatometria liquida-massa di fase invertita, con l’acquisizione in modalità di ionizzazione elettrospray positive e negative.
Abstract
Comprendere le interazioni tra geni, ambiente e gestione nella pratica agricola potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità dei prodotti. I dati della metabolomica forniscono una lettura di queste interazioni in un dato momento ed è informativo sullo stato biochimico di un organismo. Inoltre, singoli metaboliti o pannelli di metaboliti possono essere utilizzati come biomarcatori precisi per la resa e la previsione e la gestione della qualità. Si prevede che il metaboloma vegetale contenga migliaia di piccole molecole con proprietà fisicochimiche diverse che forniscono un’opportunità per una visione biochimica dei tratti fisiologici e della scoperta di biomarcatori. Per sfruttare questo, un obiettivo chiave per i ricercatori di metabolomica è quello di catturare la maggior parte della diversità fisica possibile all’interno di una singola analisi. Qui presentiamo un metodo di metabolomica non mirata basato sulla cromatomia-massa liquida per l’analisi del grano coltivato sul campo. Il metodo utilizza il responsabile del solvente del cromatografo liquido per introdurre una terza fase mobile e combina un tradizionale gradiente a fase invertita con un gradiente lipidico-amabile. La preparazione del grano, l’estrazione dei metaboliti, l’analisi strumentale e i flussi di lavoro di elaborazione dei dati sono descritti in dettaglio. Sono state osservate una buona precisione di massa e riproducibilità del segnale, e il metodo ha prodotto circa 500 caratteristiche biologicamente rilevanti per ogni modalità di ionizzazione. Inoltre, sono stati determinati segnali di metaboliti e di caratteristiche lipidiche significativamente diversi tra le varietà di frumento.
Introduction
Comprendere le interazioni tra geni, ambiente e pratiche di gestione in agricoltura potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità dei prodotti. I metaboliti delle piante sono influenzati da fattori quali il genoma, l’ambiente (clima, precipitazioni, ecc.), e in un ambiente agricolo, il modo in cui vengono gestite le colture (cioè l’applicazione di fertilizzanti, fungicidi ecc.). A differenza del genoma, il metaboloma è influenzato da tutti questi fattori e quindi i dati metabolomici forniscono un’impronta biochimica di queste interazioni in un determinato momento. Di solito ci sono uno dei due obiettivi per uno studio basato sulla metabolomica: in primo luogo, per ottenere una comprensione più profonda della biochimica dell’organismo e aiutare a spiegare il meccanismo di risposta alla perturbazione (stress abiotico o biotico) in relazione alla fisiologia; e in secondo luogo, associare i biomarcatori alla perturbazione in esame. In entrambi i casi, il risultato di avere queste conoscenze è una strategia di gestione più precisa per raggiungere l’obiettivo di migliorare le dimensioni e la qualità della resa.
Si prevede che il metaboloma vegetale contenga migliaia1 di piccole molecole con varie proprietà fisiochimiche. Attualmente, nessuna piattaforma metabolomica (prevalentemente spettrometria di massa e spettroscopia a risonanza magnetica nucleare) può catturare l’intero metaboloma in un’unica analisi. Lo sviluppo di tali tecniche (preparazione del campione, estrazione e analisi dei metaboliti), che forniscono il più grande copertura possibile del metaboloma all’interno di una singola corsa analitica, è un obiettivo chiave per i ricercatori di metabolomica. Precedenti analisi metabolomiche non mirate del grano di grano hanno combinato i dati provenienti da più separazioni cromatografiche e polarità di acquisizione e/o strumentazione per una maggiore copertura del metaboloma. Tuttavia, ciò ha richiesto la preparazione e l’acquisizione separata dei campioni per ogni modalità. Ad esempio, Beleggia et al.2 ha preparato un campione derivatato per l’analisi GC-MS degli analiti polari oltre all’analisi GC-MS degli analiti non polari. 3 ha utilizzato metodi GC e LC-MS per migliorare la copertura nelle loro analisi; tuttavia, questo approccio richiederebbe in genere preparazioni di campioni separati, come descritto in precedenza, nonché due piattaforme analitiche indipendenti. Precedenti analisi del grano di grano con GC-MS2,3,4 e LC-MS3,,5 piattaforme hanno prodotto 50 a 412 (55 identificati) caratteristiche per GC-MS, 409 per GC-MS combinato e LC-MS e diverse migliaia per un’analisi lipidomica LC-MS5. Combinando almeno due modalità in un’unica analisi, è possibile mantenere una copertura estesa del metaboloma, aumentando la ricchezza dell’interpretazione biologica e offrendo anche risparmi in termini di tempo e costi.
Per consentire l’efficiente separazione di un’ampia gamma di specie lipidiche mediante cromatografia in fase invertita, le moderne metodologie lipidomiche utilizzano comunemente un’alta percentuale di isopropanolo nel solvente elution6, fornendo l’asbilità alle classi lipidiche che altrimenti potrebbero essere irrisolte dalla cromatografia. Per un’efficiente separazione dei lipidi, la fase mobile iniziale è anche molto più alta nella composizione organica7 rispetto ai tipici metodi cromatografici a fase invertita, che considerano altre classi di molecole. L’alta composizione organica all’inizio del gradiente rende questi metodi meno adatti a molte altre classi di molecole. In particolare, la cromatografia liquida di fase invertita utilizza un gradiente di solvente binario, a partire da una composizione per lo più acquosa e aumentando nel contenuto organico con l’aumentare della forza di eluizione della cromatografia. A tal fine, abbiamo cercato di combinare i due approcci per ottenere la separazione delle classi lipidiche e non lipidiche dei metaboliti all’interno di una singola analisi.
Qui, presentiamo un metodo cromatografico che utilizza una terza fase mobile e consente una fase invertita tradizionale combinata e un metodo di cromatografia appropriata alla lipomica utilizzando una preparazione di un singolo campione e una colonna analitica. Abbiamo adottato molte delle misure di controllo della qualità e dei passaggi di filtraggio dei dati che sono stati precedentemente implementati in studi prevalentemente clinici sulla metabolomica. Questi approcci sono utili per determinare caratteristiche robuste con elevata riproducibilità tecnica e rilevanza biologica ed esclude quelle che non soddisfano questi criteri. Ad esempio, vengono descritte l’analisi ripetuta dell’esempio QC in pool8, la correzione QC9, il filtraggio dei dati9,10 e l’imputazione delle funzionalità mancanti11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo metabolomico non mirato basato su LC-MS per l’analisi del grano. Il metodo combina quattro modalità di acquisizione (fase invertita e fase invertita lipida-amabili con ionizzazione positiva e negativa) in due modalità introducendo una terza fase mobile nel gradiente di fase invertito. L’approccio combinato ha prodotto circa 500 caratteristiche biologicamente rilevanti per polarità iosata con circa la metà di queste significativamente diverse in intensità tra le varietà di frumento. Cambia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il programma West Australian Premier Agriculture and Food Fellowship (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) e il Premier’s Fellow, il professor Simon Cook (Centro per Agricoltura digitale, Università Curtin e Università di Murdoch). Le sperimentazioni sul campo e la raccolta di campioni di grano sono stati supportati dal programma Royalties for Regions dell’Australia Occidentale. Riconosciamo Grantley Stainer e Robert French per i loro contributi alle prove sul campo. La Bioplatforms Australia, finanziata da NCRIS, è riconosciuta per il finanziamento delle attrezzature.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referências
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- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
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