無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析
Summary
小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。
Abstract
遺伝子間の相互作用、農業における環境と管理を理解することで、製品収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。メタボロミクスデータは、特定の時点でこれらの相互作用の読み取りを提供し、生物の生化学的状態を有益にします。さらに、個々の代謝産物または代謝産物のパネルは、収量および品質予測および管理のための正確なバイオマーカーとして使用することができる。植物のメタボロムは、生理学的特徴とバイオマーカー発見に生化学的洞察の機会を提供する様々な物理化学的特性を有する何千もの小分子を含むことが予測される。これを利用するために、メタボロミクス研究者にとって重要な目的は、単一の分析で可能な限り多くの物理化学的多様性を捉えるためです。ここでは、フィールド成長小麦の分析のための液体クロマトグラフィー質量分析ベースの未標的メタボロミクス法を提示する。この方法は、液体クロマトグラフ四級溶媒マネージャーを使用して第3移動相を導入し、従来の逆相勾配と脂質を受け入れ可能な勾配と組み合わせたものです。穀物調製、代謝物抽出、器械分析およびデータ処理ワークフローについて詳細に説明する。質量精度と信号再現性が良好で、この方法はイオン化モードごとに約500の生物学的関連特徴を生み出した。また、小麦品種間の代謝産物および脂質特徴シグナルが有意に異なって決定された。
Introduction
農業における遺伝子、環境、管理慣行の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。植物代謝物は、ゲノム、環境(気候、降雨など)などの要因の影響を受け、農業環境では作物の管理方法(肥料の適用、殺菌剤など)が影響を受けます。ゲノムとは異なり、メタボロームはこれらの要因の影響を受けるため、メタボロミクスデータは特定の時点でこれらの相互作用の生化学的指紋を提供する。メタボロミクスベースの研究には通常、生物の生化学の深い理解を達成し、生理学に関連して摂動(非生物的または生物的ストレス)への応答メカニズムを説明するのを助けるという2つの目標のうちの1つがあります。そして第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。どちらの場合も、この知識を持つことの結果は、歩留まりのサイズと品質を向上させるという目標を達成するためのより正確な管理戦略です。
植物のメタボロムは、様々な物理化学的特性を有する数千1個の小分子を含むと予測されている。現在、メタボロミクスプラットフォーム(主に質量分析と核磁気共鳴分光法)は、単一の分析でメタボローム全体を捕捉することはできません。メタボロミクス研究者にとって、メタボロムの可能な範囲を可能な限り多く提供するこのような技術(サンプル調製、代謝産物抽出および分析)の開発は、メタボロミクス研究者にとって重要な目的です。小麦粒の以前のターゲットを持っていないメタボロミクス分析は、複数のクロマトグラフィー分離と取得極性および/またはインストゥルメンテーションからのデータを組み合わせて、より大きなメタボロームカバレッジを実現しました。しかし、これは、各モダリティのために別々に調製し、取得するサンプルを必要としました。例えば、ベレグギアら2は、非極性分析体のGC-MS分析に加えて、極性分析体のGC-MS分析のための誘導体化サンプルを調製した。Dasら 3は、分析のカバレッジを改善するために GC-と LC-MS の両方の方法を使用しました;ただし、この方法では、一般に、上記のサンプル準備と 2 つの独立した分析プラットフォームが必要になります。GC-MS5 2、3、43および4LC-MS3を用いた小麦穀物の以前の分析は、GC-MSの50〜412(同定された55)機能、GC-MSおよびLC-MSを組み合わせた409、LC-MS脂質分析5のための数千の機能をもたらした。2少なくとも2つのモードを1つの分析に組み合わせることで、拡張されたメタボロームカバレッジを維持することができ、生物学的解釈の豊かさを高める一方で、時間とコストの両方で節約を提供します。
逆相クロマトグラフィーによる広範な脂質種の効率的な分離を可能にするために、現代のリピドミクス方法論は、溶出溶媒6中のイソプロパノールの高い割合を一般的に使用し、クロマトグラフィーによって解決されない可能性のある脂質クラスに無変性を提供する。効率的な脂質分離のために、開始移動相はまた、分子の他のクラスを考慮する典型的な逆相クロマトグラフィー法よりも有機組成物7においてはるかに高い。勾配の開始時の高い有機組成物は、これらの方法を分子の他の多くのクラスにあまり適さない。最も顕著なのは、逆相液体クロマトグラフィーは、二分溶媒勾配を採用し、クロマトグラフィーの溶出強度が増加するにつれて、ほとんど水性組成から始まり、有機含有量が増加する。この目的のために、我々は、単一の分析内で代謝産物の脂質と非脂質クラスの両方の分離を達成するために、2つのアプローチを組み合わせることを目指した。
ここでは、第3移動相を用いたクロマトグラフィー法を紹介し、単一サンプル調製物と1つの分析カラムを用いた従来の逆転相とリピドミクスに適したクロマトグラフィー法を組み合わせることを可能にする。我々は、これまで主に臨床メタボロミクス研究で実施された品質管理措置およびデータフィルタリングステップの多くを採用してきました。これらのアプローチは、高い技術的再現性と生物学的関連性を持つ堅牢な特徴を決定するのに有用であり、これらの基準を満たしていないものを除外します。例えば、我々は、プールされたQCサンプル8、QC補正9、データフィルタリング9、10の10反復分析と欠損特徴11の偽装について説明する。9
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、小麦の分析のためのLC-MSベースの非標的メタボロミクス法を紹介する。この方法は、逆相勾配に第3移動相を導入することにより、4つの取得モード(逆相および脂質アメ有効逆相と正イオン化と正負イオン化を伴う)を2つのモードに組み合わせたものです。組み合わせアプローチは、イオン極性あたり約500の生物学的関連特徴を生み出し、その約半分は小麦品種間の強度が有意に異な…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、西オーストラリア州首相の農業・食糧フェローシップ・プログラム(西オーストラリア州政府の雇用・観光・科学・イノベーション省)とサイモン・クック教授(センター)を認めたい。デジタル農業、カーティン大学、マードック大学)。フィールドトライアルと穀物サンプルコレクションは、西オーストラリア州の地域ロイヤリティプログラムの政府によって支援されました。グラントリー・ステイナーとロバート・フレンチがフィールドトライアルに貢献したのを認めます。NCRISが出資するバイオプラットフォームオーストラリアは、機器の資金調達で認められています。
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referências
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