Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы
Summary
Представлен метод нецелевого анализа метаболитов и липидов зерна пшеницы. Протокол включает в себя метод извлечения метаболита ацетонитрила и обратную фазовую методологию жидкой хроматографии-масс-спектрометрии, с приобретением в положительных и отрицательных режимах ионизации электроспрея.
Abstract
Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и управлением в сельскохозяйственной практике может позволить более точнопрогнозировать и управить урожайность и качество продукции. Метаболомика данные обеспечивает чтение из этих взаимодействий в данный момент времени и информативным биохимического статуса организма. Кроме того, отдельные метаболиты или панели метаболитов могут быть использованы в качестве точных биомаркеров для прогнозирования и управления качеством. По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи мелких молекул с разнообразными физикохимическими свойствами, которые дают возможность биохимическому пониманию физиологических признаков и открытию биомаркеров. Чтобы использовать это, ключевой целью исследователей метаболомики является захват как можно больше физико-химического разнообразия в рамках одного анализа. Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики жидкой хроматографии-масс-спектрометрии для анализа пшеничного зерна, выращенного на местах. Метод использует менеджер растворителя каломатографа жидкостного хроматографа для введения третьей мобильной фазы и сочетает в себе традиционный градиент обратной фазы с липидно-податливым градиентом. Подробно описаны подготовка зерна, извлечение метаболита, инструментальный анализ и обработка данных. Наблюдалась хорошая точность массы и воспроизводимость сигнала, и метод дал около 500 биологически значимых функций в режиме ионизации. Кроме того, были определены значительно разные метаболитные и липидные сигналы между сортами пшеницы.
Introduction
Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и практикой управления в сельском хозяйстве может позволить более точнопрогнозировать и управиться выходом и качеством продукции. Метаболиты растений зависят от таких факторов, как геном, окружающая среда (климат, осадки и т.д.), а в сельском хозяйстве управляется тем, как управляются сельскохозяйственные культуры (т.е. применение удобрений, фунгицидов и т.д.). В отличие от генома, метаболом находится под влиянием всех этих факторов и, следовательно, метаболомика данные обеспечивает биохимический отпечаток этих взаимодействий в определенное время. Есть, как правило, одна из двух целей для метаболомики на основе исследования: во-первых, для достижения более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить механизм реагирования на возмущение (абиотических или биотических стресс) в отношении физиологии; и, во-вторых, связать биомаркеры с исследуемыми возмущениями. В обоих случаях результатом наличия этих знаний является более точная стратегия управления для достижения цели повышения размера и качества урожайности.
По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи1 малых молекул с разнообразными физикохимическими свойствами. В настоящее время никакие платформы метаболомики (преимущественно масс-спектрометрия и ядерная магнитно-резонансная спектроскопия) не могут зафиксировать весь метаболом в одном анализе. Разработка таких методов (подготовка образцов, метаболитная добыча и анализ), которые обеспечивают максимально большое покрытие метаболом, насколько это возможно в рамках одного аналитического запуска, является ключевой целью для исследователей метаболомики. Предыдущие нецелевые метаболомические анализы зерна пшеницы объединили данные из нескольких хроматографических разделений и закупочных полярностей и/или приборов для большего охвата метаболомами. Однако для этого необходимо подготовить и приобрести образцы отдельно для каждого метода. Например, Beleggia et al.2 подготовили производный образец для анализа полярных анализов GC-MS в дополнение к анализу GC-MS неполярных анализов неполярных анализов. Das et al.3 использовали как методы GC-, так и LC-MS для улучшения охвата в своих анализах; однако этот подход, как правило, требует отдельной выборочной подготовки, как описано выше, а также двух независимых аналитических платформ. Предыдущие анализы зерна пшеницы с использованием GC-MS2,,3,,4 и LC-MS3,,5 платформ дали от 50 до 412 (55 идентифицированных) особенностей для GC-MS, 409 для комбинированных GC-MS и LC-MS и несколько тысяч для анализа липидоми LC-MS5. Объединив по крайней мере два режима в единый анализ, расширенный охват метаболом может быть сохранен, увеличивая богатство биологического толкования, а также предлагая экономию как во времени, так и в стоимости.
Для обеспечения эффективного разделения широкого спектра липидных видов путем обратной фазы хроматографии, современные методологии липидоми обычно используют высокую долю изопропанола в растворителе elution6, обеспечивая удобство для липидных классов, которые в противном случае могли бы быть нерешенными хроматографии. Для эффективного разделения липидов, начиная передвижная фаза также гораздо выше в органическом составе7 чем типичные обратные методы хроматографических фаз, которые рассматривают другие типы молекул. Высокий органический состав в начале градиента делает эти методы менее подходящими для многих других классов молекул. В частности, обратная фаза жидкой хроматографии использует бинарный градиент растворителя, начиная с в основном водного состава и увеличивая органическое содержание по мере увеличения силы растворения хроматографии. С этой целью мы стремились объединить два подхода для достижения разделения как липидных, так и нелипидных классов метаболитов в рамках одного анализа.
Здесь мы представляем хроматографический метод, который использует третью мобильную фазу и позволяет комбинированную традиционную обратную фазу и соответствующий липидомике метод хроматографии с использованием одного образца подготовки и одной аналитической колонки. Мы приняли многие из мер по контролю качества и шагов фильтрации данных, которые ранее были реализованы в преимущественно клинических метаболомических исследованиях. Эти подходы полезны для определения надежных объектов с высокой технической воспроизводимостью и биологической репродукцией и исключают те, которые не отвечают этим критериям. Например, мы описываем повторный анализ объединенной выборки8, коррекции КК9, фильтрации данных9,,10 и вычисления отсутствующих функций11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики на основе LC-MS для анализа зерна пшеницы. Метод сочетает в себе четыре режима приобретения (обратная фаза и липидно-подливающая обратная фаза с положительной и отрицательной ионизации) в два режима путем введения третьей мобильной фаз?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить программу стипендий премьер-министра Западной Австралии по сельскому хозяйству и продовольствию (Департамент рабочих мест, туризма, науки и инноваций, правительство Западной Австралии) и стипендиат премьер-министра, профессор Саймон Кук (Центр Цифровое сельское хозяйство, Университет Кертина и Университет Мердока). Полевые испытания и сбор образцов зерна были поддержаны правительством Программы роялти для регионов Западной Австралии. Мы признаем Грантли Стейнера и Роберта Френша за их вклад в полевые испытания. NCRIS финансируемых Bioplatforms Австралии признан для финансирования оборудования.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referências
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
