Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel
Summary
Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.
Abstract
Inzicht in de interacties tussen genen, het milieu en het beheer in de landbouwpraktijk zou een nauwkeurigere voorspelling en beheer van productopbrengst en kwaliteit mogelijk kunnen maken. Metabolomics gegevens biedt een uitlezing van deze interacties op een bepaald moment in de tijd en is informatief van de biochemische status van een organisme. Verder kunnen individuele metabolieten of panelen van metabolieten worden gebruikt als nauwkeurige biomarkers voor opbrengst- en kwaliteitsvoorspelling en -beheer. De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen die een kans voor een biochemisch inzicht in fysiologische eigenschappen en biomarker ontdekking bieden bevatten. Om dit te benutten, een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers is om zo veel van de fysischchemische diversiteit mogelijk vast te leggen binnen een enkele analyse. Hier presenteren we een vloeibare chromatografie-massaspectrometrie gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van veldgekweekte tarwekorrel. De methode maakt gebruik van de vloeibare chromatograaf quaternary oplosmiddel manager om een derde mobiele fase te introduceren en combineert een traditionele omgekeerde fase gradiënt met een lipide-vatbaar gradiënt. Korrelvoorbereiding, metabolietextractie, instrumentele analyse en workflows voor gegevensverwerking worden in detail beschreven. Goede massanauwkeurigheid en signaalreproduceerbaarheid werden waargenomen en de methode leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionisatiemodus op. Verder werden aanzienlijk verschillende metaboliet- en lipidefunctiesignalen tussen tarwevariëteiten bepaald.
Introduction
Inzicht in de interacties tussen genen, omgeving en management praktijken in de landbouw zou kunnen toestaan dat een nauwkeurigere voorspelling en beheer van de opbrengst en kwaliteit van het product. Plantenmetabolieten worden beïnvloed door factoren zoals het genoom, het milieu (klimaat, regenval, enz.), en in een landbouwomgeving, de manier waarop gewassen worden beheerd (d.w.z. toepassing van kunstmest, fungicide enz.). In tegenstelling tot het genoom wordt het metabolome beïnvloed door al deze factoren en daarom biedt metabolomics gegevens een biochemische vingerafdruk van deze interacties op een bepaald moment. Er zijn meestal een van de twee doelen voor een metabolomics-gebaseerde studie: ten eerste om een dieper begrip van de biochemie van het organisme te bereiken en te helpen verklaren het mechanisme van de reactie op verstoring (abiotische of biotische stress) in relatie tot de fysiologie; en ten tweede, om biomarkers te associëren met de verstoring in studie. In beide gevallen is het resultaat van het hebben van deze kennis een nauwkeurigere managementstrategie om het doel van een betere rendementsgrootte en kwaliteit te bereiken.
De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden1 van kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen bevatten. Momenteel kunnen geen metabolomics platforms (voornamelijk massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie) het hele metabolome in één analyse vastleggen. Het ontwikkelen van dergelijke technieken (monstervoorbereiding, metabolietextractie en -analyse), die een zo groot mogelijke dekking van het metabolome binnen één enkele analytische run bieden, is een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers. Eerdere ongerichte metabolomics analyses van tarwekorrel hebben gegevens gecombineerd van meerdere chromatografische scheidingen en acquisitiepolariteiten en/of instrumentatie voor een grotere metabolomedekking. Hiervoor moeten echter monsters voor elke modaliteit afzonderlijk worden bereid en verworven. Beleggia et al.2 hebben bijvoorbeeld een gederivatiseerde steekproef voorbereid voor de GC-MS-analyse van polaire analyten naast de GC-MS-analyse van de niet-polaire analyten. Das et al.3 gebruikten zowel GC- als LC-MS-methoden om de dekking in hun analyses te verbeteren; Deze aanpak vereist echter over het algemeen afzonderlijke monsterpreparaten zoals hierboven beschreven, evenals twee onafhankelijke analytische platforms. Eerdere analyses van tarwekorrel met GC-MS2,3,4 en LC-MS3,5 platforms hebben 50 tot 412 (55 geïdentificeerde) functies opgeleverd voor GC-MS, 409 voor gecombineerde GC-MS en LC-MS en enkele duizenden voor een LC-MS lipidomics analyse5. Door ten minste twee modi te combineren in één analyse, kan een uitgebreide metabolomedekking worden gehandhaafd, waardoor de rijkdom van biologische interpretatie toeneemt en tegelijkertijd besparingen in zowel tijd als kosten worden bespaard.
Om de efficiënte scheiding van een breed scala van lipidesoorten door omgekeerde-fase chromatografie mogelijk te maken, gebruiken moderne lipidomics methodologieën vaak een hoog percentage isopropanol in het elutionoplosmiddel6, die beakeerbaarheid aan lipideklassen verstrekt die anders door de chromatografie zouden kunnen worden onopgelost. Voor een efficiënte lipidescheiding is de beginmobiele fase ook veel hoger in organische samenstelling7 dan de typische omgekeerde fasechromatografische methoden, die andere klassen van moleculen overwegen. De hoge organische samenstelling aan het begin van de gradiënt maakt deze methoden minder geschikt voor vele andere klassen van moleculen. Met name, omgekeerde fase vloeibare chromatografie maakt gebruik van een binaire oplosmiddel gradiënt, te beginnen met een meestal waterige samenstelling en toenemende organische inhoud als de elutie sterkte van de chromatografie wordt verhoogd. Hiertoe probeerden we de twee benaderingen te combineren om de scheiding van zowel lipide- als niet-lipideklassen van metabolieten binnen één analyse te bereiken.
Hier presenteren we een chromatografische methode die een derde mobiele fase gebruikt en een gecombineerde traditionele omgekeerde fase en lipidomics-geschikte chromatografiemethode mogelijk maakt met behulp van een enkele monstervoorbereiding en één analytische kolom. We hebben veel van de kwaliteitscontrolemaatregelen en gegevensfilterstappen genomen die eerder zijn geïmplementeerd in voornamelijk klinische metabolomics studies. Deze benaderingen zijn nuttig bij het bepalen van robuuste kenmerken met een hoge technische reproduceerbaarheid en biologische relevantie en sluiten degenen uit die niet aan deze criteria voldoen. We beschrijven bijvoorbeeld herhaalde analyse van het samengevoegde QC-monster8, QC-correctie9,gegevensfiltering9,10 en toerekening van ontbrekende functies11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een LC-MS-gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van tarwekorrel. De methode combineert vier acquisitiemodi (omgekeerde fase en lipide-ontvankelijke omgekeerde fase met positieve en negatieve ionisatie) in twee modi door een derde mobiele fase in het omgekeerde faseverloop te introduceren. De gecombineerde aanpak leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionpolariteit op, waarvan ongeveer de helft aanzienlijk verschilt in intensiteit tussen tarwevariëteiten. Signific…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het West-Australische Premier’s Agriculture and Food Fellowship-programma (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) en de Premier’s Fellow, professor Simon Cook (Centre for Digitale landbouw, Curtin University en Murdoch University). Veldproeven en graanmonsterverzameling werden ondersteund door de regering van het Western Australia’s Royalties for Regions-programma. We erkennen Grantley Stainer en Robert French voor hun bijdragen aan veldproeven. De door NCRIS gefinancierde Bioplatforms Australië wordt erkend voor de financiering van apparatuur.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referências
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
