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Cancer Research

मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और CD4 + T कोशिकाओं को सेज़ारी सिंड्रोम रोगियों से ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए अलग करना

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/61470
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Dermatology, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

हम सेज़री सिंड्रोम के निदान वाले रोगियों से प्राप्त पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद सीडी 4 + टी कोशिकाओं का चयन, फोरबोल 12-myristate13-एसीटेट और A23187 आयनोफोर के साथ उनकी उत्तेजना, और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए आरएनए की तैयारी।

Abstract

त्वचीय टी-सेल लिंफोमा (सीटीसीएल) परिपक्व त्वचा-होमिंग टी कोशिकाओं के परिवर्तन और अनियंत्रित प्रसार से प्राप्त होते हैं, और माइकोसिस फंगोइड्स (एमएफ) और सेज़री सिंड्रोम (एसएस) सबसे आम उपप्रकारों का प्रतिनिधित्व करते हैं। सीटीसीएल के जीन अभिव्यक्ति, आनुवंशिक परिवर्तन, और एपिजेनेटिक असामान्यताओं की विशेषता पर कई अध्ययनों के बावजूद, एमएफ / एसएस के आणविक रोगजनन अस्पष्ट बने हुए हैं। एमएफ एक त्वचा-प्रबलता के साथ अधिक सामान्य सीटीसीएल को संदर्भित करता है, और आमतौर पर त्वचा तक सीमित होता है, जबकि एसएस व्यापक त्वचा की भागीदारी के साथ सीटीसीएल का एक आक्रामक ल्यूकेमिया वाला संस्करण है और मुख्य रूप से रक्त, त्वचा और लिम्फ नोड को शामिल करने वाले नियोप्लास्टिक वितरण की विशेषता है। नैदानिक अभ्यास पर ध्यान केंद्रित करते हुए, जीन अभिव्यक्ति बायोमार्कर की पहचान में एमएफ / एसएस के निदान और उपचार में सुधार करने की भारी क्षमता है। दरअसल, हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययनों ने सामान्य और घातक टी कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में अंतर से संभावित नैदानिक बायोमार्कर की पहचान की है, जो एसएस जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार कर सकता है, और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट कर सकता है। यह पांडुलिपि एसएस के साथ निदान किए गए रोगियों से ताजा पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत पुनरुत्पादक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, सीडी 4 + मेमोरी टी कोशिकाओं (सीडी 4 + सीडी 45आरओ + टी कोशिकाओं) का चयन, रासायनिक उत्तेजना, और रोग एटियलजि में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपन्यास भविष्यवाणी आणविक मार्करों की खोज करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए उपयुक्त आरएनए की तैयारी। परमाणु विनियमन को सक्रिय करने के लिए रासायनिक एगोनिस्ट का उपयोग करने वाली उत्तेजना गतिशील प्रतिलेखन विनियमन और जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण मार्गों के लिए अधिक विशिष्ट मूल्यांकन प्रदान करती है और कोशिका झिल्ली पर टीसीआर एंटीजन हानि से उत्पन्न होने वाले अपस्ट्रीम सिग्नलिंग दोषों से उत्पन्न होने वाले भ्रमित दोषों को समाप्त करती है। उत्तेजित एसएस टी कोशिकाओं के लिए unstimulated के ट्रांसक्रिप्टोम की तुलना से प्राप्त डेटा कार्यात्मक नियामक जीन अभिव्यक्ति दोषों unmasks quiescent unstimulated कोशिकाओं के विश्लेषण से स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण से उल्लिखित विधि को अन्य टी सेल प्रतिरक्षा रोगों में टी सेल जीन अभिव्यक्ति दोषों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

त्वचीय टी-सेल लिंफोमा (सीटीसीएल), जिसमें सबसे आम उपप्रकार शामिल हैं माइकोसिस फंगोइड्स (एमएफ) और सेज़री सिंड्रोम (एसएस), परिपक्व त्वचा-होमिंग टी कोशिकाओंके परिवर्तन और अनियंत्रित प्रसार से प्राप्त बीमारियों का एक विषम समूह है। नियोप्लास्टिक टी कोशिकाओं में एक परिपक्व सीडी 4 + सीडी 45आरओ + , मेमोरी फेनोटाइप3, और व्यक्त त्वचा होमिंग आसंजन मार्कर होते हैं, जिससे एपिडर्मोट्रोपिज्म4 बढ़ जाता है, जो विशेष रूप से प्रारंभिक बीमारी में दाने के रूप में प्रकट होता है। एमएफ का नैदानिक पाठ्यक्रम अक्सर नियमित रूप से प्रबंधित देखभाल के तहत होने पर उदासीन होता है, लेकिन रोगियों का एक सबसेट अधिक उन्नत बीमारी में प्रगति कर सकता है। इन एमएफ मामलों में, त्वचा के घाव बड़े ट्यूमर में बढ़ते और मोटे हो जाते हैं, और नियोप्लास्टिक टी कोशिकाएं लिम्फ नोड्स और आंत के अंगों में फैल सकती हैं। इसके विपरीत, एसएस सीटीसीएल 5 का एक अधिक आक्रामक, ल्यूकेमिया वाला संस्करण है, जोलक्षणों के त्रिकोण की विशेषता है: सामान्यीकृत एरिथ्रोडर्मा (कुल शरीर की सतह क्षेत्र के >80%) को प्रभावित करने के रूप में परिभाषित), लिम्फैडेनोपैथी, और 1000 / मिमी से अधिककी उपस्थिति 3 सेरेब्रिफॉर्म नाभिक के साथ क्लोनल एटिपिकल टी कोशिकाओं को प्रसारित करना, जिसे सेज़री कोशिकाएं 6,7 कहा जाता है . एसएस रोगियों के लिए पूर्वानुमान एमएफ की तुलना में काफी खराब है। एसएस 0.1/100,000 की घटना दर के साथ दुर्लभ है, और कुल सीटीसीएल मामलों के लगभग 3% का प्रतिनिधित्व करताहै 8,9। सीटीसीएल आमतौर पर पुराने वयस्कों में लगभग 60 वर्ष10 की औसत आयु के साथ प्रस्तुत करता है। सीटीसीएल के लिए घटना दर बढ़ रही थी और जबकि कारण स्पष्ट नहीं है, दर 1998 के बाद से स्थिर हो गई है11,12।

एसएस का आणविक रोगजनन अस्पष्ट रहता है। आनुवांशिक, एपिजेनेटिक और जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों ने उपन्यास डेटा का एक खजाना पैदा किया है, हालांकि असंगत निष्कर्ष बने हुए हैं, मुख्य रूप से अध्ययन किए गए छोटे रोगी साथियोंके कारण 2, साथ ही प्रयोगात्मक डिजाइन और नियंत्रण आबादीमें अंतर 13,14। बेहतर जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन दोनों रोग तंत्र और पहले से अज्ञात चिकित्सीय लक्ष्यों पर प्रकाश डाल सकता है। इसलिए, इस विषम दुर्दमता को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक बड़ी रोगी आबादी से अधिक अध्ययन की आवश्यकता है। बायोमार्कर पैनल जो एक एसएस कोहोर्ट में अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट हैं, ने अन्य साथियों15 में कम समान रूप से प्रदर्शन किया है, जो एसएस16 के लिए विश्वसनीय नैदानिक और भविष्यवाणी बायोमार्कर के विकास में एक गंभीर बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। आदर्श नैदानिक बायोमार्कर लगातार और अत्यधिक घातक टी कोशिकाओं में व्यक्त किए जाएंगे, जबकि सामान्य टी कोशिकाओं में अनुपस्थित या लगभग अनुपस्थितहोंगे। रोग-विशिष्ट बायोमार्कर की खोज एसएस के लिए नैदानिक और चिकित्सीय प्रोटोकॉल की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है।

घातक और सामान्य टी कोशिकाओं दोनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को नमूना तैयारी के लिए एक कुशल और विश्वसनीय दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यहां, हम एसएस के लिए प्रासंगिक टी सेल आबादी से आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत अभी तक सरल रणनीति पर चर्चा करेंगे। हम पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMC) के अलगाव, रोग-प्रासंगिक CD4 + CD45RO + T सेल आबादी के नकारात्मक चुंबकीय चयन, कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं में अंतर को प्रकट करने के लिए रासायनिक सक्रियण, और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए आरएनए की तैयारी पर चर्चा करेंगे। वर्तमान प्रोटोकॉल में, रासायनिक सक्रियण को फोरबोल मिरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) और कैल्शियम आयनोफोर (ए 23187) 18,19 का उपयोग करके किया गया है, क्योंकि पिछले अध्ययनों ने सीटीसीएल में दोषपूर्ण टी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग दिखाया है, और पीएमए / ए 23187 के साथ उत्तेजना टी-सेल रिसेप्टर20,21 को बाईपास करती है। इसके अलावा, पीएमए / ए 23187 साइटोकाइन जीन सक्रियण के लिए आवश्यक परमाणु संकेतों के अधिक प्रत्यक्ष समीपस्थ सक्रियण की अनुमति देता है। अंत में, टी कोशिकाओं की उत्तेजना जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में अंतर्दृष्टि का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करती है जिसे टी कोशिकाओं को आराम करने से प्राप्त नहीं किया जा सकता है जहां गतिशील परिवर्तन अनुपस्थित है।

Protocol

मानव कोशिकाएं संभावित रूप से संक्रामक होती हैं। इसलिए, प्रयोगों को व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य प्रशासन (ओएसएचए) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के रूप में चर्चा की गई आवश्यक सावधानियों और प्रक्रियाओं के अनुसार सख्ती से किया जाता है।

1. पूरे रक्त से PBMCs का अलगाव

  1. तालिका 1 से आवश्यक सभी सामग्रियों को इकट्ठा करें और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर लाएं। गर्म RP10F करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस. सेंट्रीफ्यूज को आरटी में समायोजित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन और सेल काउंटिंग को छोड़कर, जैविक सुरक्षा कैबिनेट में व्यवहार्य कोशिकाओं का उपयोग करके सभी चरणों को निष्पादित करें।
  2. एंटीकोआगुलेंट युक्त पांच 10 मिलीलीटर ट्यूबों (वांछित मात्रा) में रक्त प्राप्त करें। पूरे रक्त को परिवेश के तापमान (18\u201224 °C) पर स्टोर करें। रक्त के नमूने को संसाधित करने के लिए मानव अनुसंधान विषय संख्या के साथ लेबल 50 एमएल पृथक्करण ट्यूब।
  3. मिलान विषय संख्या के साथ प्रत्येक पृथक्करण ट्यूब (ओं) में 10\u201215 mL रक्त स्थानांतरित करें। हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ रक्त को कम से कम 2 गुना पतला करें। प्रति ट्यूब पतला रक्त के 35 मिलीलीटर से अधिक न करें।
  4. ध्यान से और धीरे-धीरे घनत्व माध्यम के ~ 13 मिलीलीटर के साथ रक्त underlay. ट्यूब के नीचे पारदर्शी घनत्व माध्यम के माध्यम से देखो, और पिपेट लगभग खाली होने पर पिपेट को रोकदें (बुलबुला रिलीज को रोकने के लिए)। ध्यान से रक्त और घनत्व मध्यम परतों के मिश्रण से बचने के लिए पिपेट को हटा दें।
  5. ध्यान से परतों को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज के लिए भरा जुदाई ट्यूबों हस्तांतरण.
  6. सेंट्रीफ्यूज ब्रेक ऑफ के साथ 30 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज (शून्य पर सेट मंदी)।
    नोट:: यदि centrifuge केवल rpm प्रदर्शित करता है, तो 500 x g के लिए rpm समकक्ष का अनुमान लगाने के लिए रोटर विनिर्देशों से परामर्श करें।
  7. ध्यान से परतों को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज से पृथक्करण ट्यूबों को हटा दें। बफी कोट का निरीक्षण करें, जो घनत्व माध्यम और प्लाज्मा परतों के बीच में बनाया गया है।
  8. ऊपरी प्लाज्मा अंश के अधिकांश को हटाने और छोड़ने के लिए शीर्ष से पिपेट, ताकि 10 एमएल बफी कोट के ऊपर रहे। ध्यान से और धीरे-धीरे buffy कोट इकट्ठा. दो पृथक्करण ट्यूबों से बफी कोट को एक नए पूर्व-लेबल और बाँझ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
  9. एचबीएसएस के साथ कम से कम 2 गुना पीबीएमसी को पतला करें, जिससे प्रत्येक नई ट्यूब में मात्रा 50 मिलीलीटर तक पहुंच जाए। सेंट्रीफ्यूज ब्रेक को पूर्ण करने के लिए स्विच करना याद रखें। गोली PBMCs centrifugation द्वारा 400 x g पर 10 मिनट के लिए. Supernatant के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में निकालें और गोली ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे नल.
  10. अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को लाइस करने के लिए, प्रत्येक सेल पैलेट को अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) लाइसिस बफर प्रति 10 मिलीलीटर मूल रक्त मात्रा में 1\u20122 mL में फिर से निलंबित करें। ठीक 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। HBSS के बराबर या अधिक मात्रा के साथ lysis को तुरंत रोकें और 50 mL करने के लिए मात्रा को समायोजित करें। 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  11. supernatant निकालें और सेल गोली ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे नल. एक ही दाता से पूल कोशिकाओं. HBSS के साथ 50 mL तक वॉल्यूम लाएं। 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  12. supernatant निकालें और सेल गोली ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे नल. गर्म RP10F माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और ट्रिपैन नीले रंग का उपयोग करके व्यवहार्य सेल गिनती के लिए एक एलीकोट लें।
  13. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में कुल सेल संख्या की गणना करें।

2. PBMCs से CD4+ CD45RO+ T कोशिकाओं का शुद्धिकरण

नोट: PBMCs से CD4+ CD45RO+ T कोशिकाओं का शुद्धिकरण मामूली संशोधनों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय पृथक्करण ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके किया जाता है। इनक्यूबेशन समय के लिए किट मैनुअल का पालन करना पसंद किया जाता है क्योंकि प्रत्येक वाणिज्यिक किट के अपने निर्देश होते हैं।

  1. चयन बफर के 10 mL में PBMCs की वांछित मात्रा को धोएं। 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें और गोली ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे नल.
  2. चयन बफर में PBMCs को 5 x 107 कोशिकाओं / mL तक पतला करें और उन्हें पॉलीस्टीरीन राउंड-बॉटम ट्यूब (12 x 75 मिमी) के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।
  3. नमूना के प्रति 1 मिलीलीटर एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μL जोड़ें, और धीरे से मिश्रण। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. उपयोग से ठीक पहले, उच्च गति पर 30 सेकंड के लिए भंवर चुंबकीय कण। PBMCs युक्त ट्यूब में नमूने के प्रति 1 mL चुंबकीय कणों के 50 μL जोड़ें, और धीरे से मिश्रण।
  5. चयन बफर के साथ 2.5 मिलीलीटर तक मात्रा लाएं और धीरे से मिलाएं। चुंबक में ट्यूब (ढक्कन के बिना) रखें, और 2.5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  6. चुंबक उठाओ, और एक निरंतर गति में, एक नई बाँझ ट्यूब में समृद्ध सेल निलंबन डालने के लिए चुंबक और ट्यूब को उलटें।
  7. वसूली बढ़ाने के लिए, चुंबक में शेष ट्यूब में चयन बफर के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें, immobilized मोतियों परेशान किए बिना। एक और 2.5 मिनट के लिए चुंबक में रखें, और अतिरिक्त कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए चरण 2.6 को दोहराएं।
  8. ट्राइपैन नीले रंग का उपयोग करके व्यवहार्य सेल गिनती के लिए एक ऐलीकोट लें। हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके कुल सेल संख्या की गणना करें।
  9. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता की पुष्टि करें (चित्रा 3)।

3. रासायनिक सक्रियण

  1. CD4+ CD45RO+ T कोशिकाओं को गर्म RP10F माध्यम के साथ 5 x 106 कोशिकाओं / mL में समायोजित करें, और वांछित आकार के संस्कृति व्यंजनों में कोशिकाओं को वितरित करें। एक humidified 37 °C 5% CO2 इनक्यूबेटर में रात भर आराम कोशिकाओं.
  2. गोली 10 मिनट के लिए 400 x g पर centrifugation द्वारा आराम कोशिकाओं. supernatant निकालें और सेल गोली ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे नल.
  3. गर्म RP10F माध्यम के साथ 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें, और तीन बाँझ, पेंच-कैप ट्यूबों में से प्रत्येक में 0.5\u20121 x 107 कोशिकाओं को वितरित करें।
    नोट:: यदि पर्याप्त कक्ष उपलब्ध हैं, डुप्लिकेट उत्तेजनाओं या अतिरिक्त समय बिंदु प्रयोगात्मक डिज़ाइन में शामिल किया जा सकता है।
  4. पीएमए और A23187 के साथ ट्यूब 2 और 3 में कोशिकाओं को उत्तेजित करें। 25 ng/mL और A23187 से 500 ng/mL में PMA जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। ट्यूब 1 में कोशिकाओं के लिए डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की एक समान मात्रा जोड़ें जो वाहन (नियंत्रण) के रूप में काम करेगा। उदाहरण के लिए, यदि पीएमए के 1 μL और A23187 के 1 μL का उपयोग कर रहे हैं, तो वाहन ट्यूब में DMSO के 2 μL जोड़ें। सभी ट्यूबों में 0.5% से नीचे DMSO की अंतिम एकाग्रता रखें।
  5. ट्यूबों पर कैप्स को ढीला करें, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2 घंटे (ट्यूब2 ) और 6 एच (ट्यूब 1 और 3) के लिए वापस करें। संकेतित समय पर, 10 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं।
  6. लाइसिस से पहले, सेल पैलेट को परेशान किए बिना, जितना संभव हो उतना supernatant को छोड़ दें।
  7. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अलगाव किट के निर्देशों द्वारा निर्देशित कोशिकाओं को तुरंत लाइस करें (सामग्री की तालिका देखें)। आरएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ें, या अतिरिक्त नमूनों के साथ बाद में संसाधित करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर लिसेट को फ्रीज करें।
    नोट: आरएनए शुद्धता और अखंडता को माइक्रोकेशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है।
  8. वैकल्पिक: शुद्ध आरएनए नमूने से डीएनए के सभी निशानों को पूरी तरह से हटाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आरएनए क्लीन अप किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में एसएस रक्त से पीबीएमसी के अलगाव, नकारात्मक चयन द्वारा CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं का शुद्धिकरण, शुद्ध टी कोशिकाओं की उत्तेजना, और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए कुल आरएनए का अलगाव शामिल है। चित्रा 1 पूरे रक्त से PBMC अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करता है। कृपया ध्यान दें कि एसएस PBMCs की कुल उपज रक्त की मात्रा शुरू करने और प्रत्येक रोगी के ट्यूमर बोझ को प्रसारित करने के साथ भिन्न होगी। हमारी प्रयोगशाला में, एसएस पीबीएमसी की औसत उपज 4.6 × 106 कोशिकाएं / एमएल पूरे रक्त की थी (1.85 × 106 - 3.25 x 107 कोशिकाएं / एमएल 7 एसएस के लिए)। पृथक PBMCs की औसत व्यवहार्यता 95\u201299% थी। चित्र 2 चयनित CD4+ CD45RO+ मेमोरी T कोशिकाओं की उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता दिखाता है. एसएस पीबीएमसी से सीडी 4 + सीडी 45आरओ + टी कोशिकाओं की औसत उपज 75% (75.6% - 84%) थी, जबकि ल्यूकोरोडक्शन सिस्टम (एलआरएस) कक्षों से प्राप्त सामान्य दाताओं (एनडी) पीबीएमसी से 15.9% (3% - 30%) थी। इस नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त CD4+ CD45RO+ T कोशिकाओं की व्यवहार्यता और शुद्धता लगातार उच्च रही है (चित्र3)।

हमने पहले एसएस और एनडी टी कोशिकाओं दोनों के ट्रांसक्रिप्टोम में कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए माइक्रोएरे के साथ ऊपर सक्रियण प्रोटोकॉल को जोड़ा था, और यह प्रदर्शित किया है कि एसएस मेमोरी टी कोशिकाएं और एसएस पीबीएमसी एनडी टी कोशिकाओं और पीबीएमसी 19,22,23 की तुलना में साइटोकाइन और अन्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीन को खराब रूप से व्यक्त करते हैं। चित्रा 4 एनडी टी कोशिकाओं में आईएल 4, आईएल 10, आईएल 13 और आईएल 22 सहित कई साइटोकाइन जीनों के मजबूत सक्रियण को दर्शाता है, लेकिन एसएस टी कोशिकाओं में नहीं। एसएस टी कोशिकाओं में कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति में इस दोष की पुष्टि अन्य समूहों द्वारा की गईहै 24। इसके अलावा, एनडी टी कोशिकाओं में सामान्य रूप से व्यक्त नहीं किए जाने वाले कई जीन एसएस टी कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, दोनों आराम से और उत्तेजना के बाद (चित्रा 4)। इनमें पहले से वर्णित एसएस बायोमार्कर जीन DNM3, PLS3, TOX और TWIST1 25,26,27, साथ ही ANK1 और SGCE शामिल हैं, जिन्हें पहली बार हमारे समूह द्वारा रिपोर्ट किया गया था। ये सकारात्मक बायोमार्कर एसएस में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, लेकिन एनडी नहीं, और नकारात्मक बायोमार्कर से जुड़े तकनीकी नुकसान से बचते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: पूरे रक्त से पीबीएमसी अलगाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पृथक PBMCs से CD4+ स्मृति T कोशिकाओं का नकारात्मक चयन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: CD4+ CD45RO+ T कोशिकाओं की शुद्धता की पुष्टि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा की गई थी। लिम्फोसाइट्स को प्रकाश स्कैटर (ए) द्वारा गेटेड किया गया था, जीवित लिम्फोसाइट्स को eFluor780 व्यवहार्यता डाई (बी) को बाहर रखा गया था, और (सी) गैर-चयनित सामान्य दाताओं (एनडी) का प्रतिनिधित्व करता है। नकारात्मक चयन के परिणामस्वरूप एनडी (डी) और एसएस रोगियों (ई) में सीडी 45आरओ + टी कोशिकाओं की लगभग शुद्ध आबादी हुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आराम करने और एसएस और एनडी से CD4 + CD45RO + मेमोरी टी कोशिकाओं को सक्रिय करने में विभेदक जीन अभिव्यक्ति। जीन अभिव्यक्ति z-स्कोर को लाल (उच्च अभिव्यक्ति) से हरे (कम अभिव्यक्ति) तक एक रंग पैमाने द्वारा दर्शाया जाता है। गर्मी के नक्शे के शीर्ष पर रंगीन सलाखों सेल उपचार का प्रतिनिधित्व करता है: नकली / वाहन का इलाज (लाल), 2 ज उत्तेजित (नीला), और 6 ज उत्तेजित (पीला)। कई एसएस बायोमार्कर जीन अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं और साइटोकाइन जीन एनडी टी कोशिकाओं की तुलना में एसएस टी कोशिकाओं में खराब रूप से व्यक्त किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मकों
घनत्व मध्यम लिम्फोसाइट पृथक्करण मध्यम, Ficoll-Hypaque, या घनत्व के साथ समकक्ष घनत्व माध्यम = 1.077-1.080g / ml 20oC पर।
HBSS 1x हांक का संतुलित नमक समाधान, 4.2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.2
RP10F RPMI 1640 मध्यम, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x पेनिसिलिन-streptomycin समाधान, पीएच 7.2
ACK लाइसिस बफर 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH को समायोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। यह ~ 7.3 होना चाहिए।
चयन बफ़र 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA
phorbol12-myristate13-एसीटेट (PMA) DMSO में 50 μg/ml
A23187 आयनोफोर DMSO में 500 μg/

तालिका 1: अभिकर्मकों.

Discussion

PBMCs को अलग करने के कई तरीके विकसित किए गए हैं, और प्रत्येक के अपने फायदे और सीमाएंहैं। हम नियमित रूप से एंटीकोआगुलेंट युक्त पांच 10 मिलीलीटर ट्यूबों में 50 मिलीलीटर तक रक्त एकत्र करते हैं। PBMC अलगाव के लिए रक्त की मात्रा कई कारकों पर निर्भर करती है जैसे स्वास्थ्य और अनुसंधान विषय की उम्र और फ्लेबोटोमिस्ट विशेषज्ञता पर भी। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण प्रक्रियात्मक चरण चरण ढाल का गठन है। खराब लेयरिंग के परिणामस्वरूप इंटरफ़ेस पर तलछट के लिए PBMCs की आंशिक या पूर्ण विफलता हो सकती है। हम यहां वर्णित अंडर-लेयरिंग विधि को पसंद करते हैं, क्योंकि नीचे की परत शुरू करना आसान है। रक्त के नीचे सभी घनत्व माध्यम को पूरी तरह से वितरित करने के लिए, बिना किसी हवा के रिसाव के साथ एक पिपेट सहायता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। अवांछित सेल प्रकारों द्वारा PBMC अंश के संदूषण को बफी कोट के सावधानीपूर्वक और सुसंगत संग्रह द्वारा कम किया जा सकता है, जिसे प्रत्येक अलगाव के लिए उसी तरह से किया जाना चाहिए। यदि PBMCs को आगे fractionated नहीं किया जाएगा, तो अलगाव के बीच घनत्व ढाल और प्लाज्मा परतों की विभिन्न मात्राओं को इकट्ठा करने से बचा जाना चाहिए। आरबीसी लाइसिस को डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर आरबीसी- और रेटिकुलोसाइट-व्युत्पन्न आरएनए को दूषित करने के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए किया जाता है। हाइपोटोनिक लाइसिस को अतिरिक्त आइसोटोनिक बफर द्वारा बाधित किया जाएगा।

टी सेल सबसेट का आगे अलगाव आणविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हमने अवांछित सेल प्रकारों को हटाने के लिए नकारात्मक चयन द्वारा बाद के CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं के चयन का वर्णन किया है। नकारात्मक चयन सभी अवांछित कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सेल सतह मार्करों को पहचानने वाले एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। एंटीबॉडी लेपित कोशिकाओं को तब चुंबकीय मोतियों द्वारा हटा दिया जाता है। यह चयन प्रोटोकॉल अवांछित कोशिकाओं को हटा देता है, जबकि अछूते और अउत्तेजित लक्ष्य कोशिकाओं को मुक्त फ्लोटिंग रहने की अनुमति देता है, जो जीन सक्रियण का अध्ययन करने में आवश्यक है। हालांकि, सेल clumps से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो चयनित CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की अंतिम शुद्धता को कम करता है। चयन बफर में मौजूद Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) सेल clumping को कम करता है। टी कोशिकाओं की उपज रक्त की प्रारंभिक मात्रा, रोगी चर जैसे कि रोगी को प्रशासित किए जा रहे उपचार और नमूना संग्रह के समय रोग चरण जैसे कारकों पर निर्भर करती है। रोगियों को दिए गए उपचार से कोशिका व्यवहार्यता भी प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, फोटोफेरेसिस जैसी किसी भी प्रक्रिया से पहले नमूना संग्रह का CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की शुद्धता पर भी सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। हमने देखा है कि फोटोफेरेसिस उपचार प्रक्रिया के बाद नमूना संग्रह का CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की उपज पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।

एसएस रोगियों से नियोप्लास्टिक टी सेल क्लोन अक्सर एक परिपक्व, मेमोरी सीडी 4 टी सेल फेनोटाइप29,30 के अनुरूप सतह मार्करों को व्यक्त करते हैं। तथापि, कभी-कभी सीडी 4, सीडी45आरओ, सीडी45आरए, सीडी 7 और/या सीडी2631 सहित सतह मार्करों के संबंध में फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी देखी गई है। पिछले अध्ययनों ने एसएस रोगियोंके बीच CD45RO और CD45RA अभिव्यक्ति में विषमता को भी दिखाया है, जबकि अधिकांश एसएस मामले अभी भी CD45RO + हैं। Roelens et al.31 ने यह भी दिखाया कि एसएस भोले (टीएन), केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), संक्रमणकालीन स्मृति (टीटीएम), प्रभावक स्मृति (टीईएम), और टर्मिनल प्रभावक स्मृति (टीईएमआरए) सबसेट की मिश्रित आबादी के साथ अंतर-व्यक्तिगत और इंट्राइंडिविजुअल विषमता प्रदर्शित कर सकता है। हालांकि, उनके परिणाम स्पष्ट रूप से दिखाते हैं कि अधिकांश एसएस कोशिकाओं में टीसीएम फेनोटाइप होता है। हमने अपने अध्ययन को एसएस रोगियों में सबसे आम CD45RO + सतह इम्यूनोफेनोटाइप पर केंद्रित किया, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइप की पुष्टि की। रोगियों में टी सेल सबसेट के अध्ययन की योजना बनाने में, अध्ययन की जा रही बीमारी की फेनोटाइपिक विषमता पर विचार करना महत्वपूर्ण है, और इसलिए शुद्धिकरण रणनीति को विश्लेषण के लिए वांछित टी सेल आबादी प्राप्त करने के लिए आवश्यक रूप से समायोजित किया जा सकता है।

कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए टी कोशिकाओं और पीबीएमसी को उत्तेजित करने के कई तरीके हैं। हम रासायनिक सक्रियण (पीएमए + ए 23187 आयोनोफोर) पसंद करते हैं, क्योंकि हम नाभिक में जीन विनियमन में रुचि रखते हैं। रासायनिक सक्रियण इस उद्देश्य के लिए एक सबसे अच्छा विकल्प है क्योंकि यह एक व्यापक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है और एंटीजन विशिष्ट उत्तेजना की तुलना में अधिक समान है। पीएमए एक छोटा कार्बनिक यौगिक है जो कोशिका झिल्ली के माध्यम से साइटोप्लाज्म में फैलता है, और सीधे प्रोटीन किनेज को सक्रिय करता है सी ए 23187 कैल्शियम को झिल्ली से गुजरने की अनुमति देता है। ये यौगिक सतह रिसेप्टर्स को बाईपास करते हैं, और एक साथ सीडी 28 द्वारा मध्यस्थता वाले सह-उत्तेजना के साथ टी सेल रिसेप्टर बंधाव के प्रभावों की नकल करते हैं। रसायन कई इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परमाणु प्रतिलेखन कारक सक्रियण और साइटोकाइन जीन के अपरेगुलेशन होते हैं जो प्रतिलेखन सक्रियण के लिए सुलभ होते हैं। यद्यपि रासायनिक सक्रियण और CD3CD28 बंधाव सामान्य कोशिकाओं32 में आश्चर्यजनक रूप से समान वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का उत्पादन करते हैं, पीएमए + ए 23187 के साथ रासायनिक सक्रियण एक अच्छा विकल्प है क्योंकि एसएस टी कोशिकाएं टीसीआर घटकों33 सहित सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति खो सकती हैं। चोंग एट अल.22 ने पीएमए / ए 23187 के बीच साइटोकाइन जीन के सक्रियण की तुलना सामान्य, शुरुआती एमएफ / सीटीसीएल और देर से एमएफ / सीटीसीएल रोगियों से पीबीएमसी में एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी से की। उन्होंने बताया कि पीएमए / ए 23187 ने एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 उत्तेजना की तुलना में आईएल -2 जीन के अधिक तेजी से और तीव्र सक्रियण का कारण बना। इसके अतिरिक्त, उन्होंने दिखाया कि एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 एंटीबॉडी के साथ धीमी सक्रियण कैनेटीक्स संभावित रूप से क्रॉस-लिंकिंग और उत्तेजना के लिए आवश्यक झिल्ली सिग्नलिंग से है। इसके अलावा, अध्ययन किए गए विभिन्न सेल आबादी के बीच साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति में रुझानों को पीएमए / ए 23187 के साथ संरक्षित किया गया था। चूंकि, हम जीन अभिव्यक्ति सक्रियण में रुचि रखते हैं, रासायनिक उत्तेजना एक आदर्श दृष्टिकोण है क्योंकि यह एक व्यापक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है और एंटीजन विशिष्ट उत्तेजना की तुलना में अधिक सुसंगत है। CD3/CD28 बंधाव झिल्ली आधारित सिग्नल ट्रांसडक्शन में महत्वपूर्ण मार्गों की जांच करने के लिए आदर्श है। इसके अलावा, रासायनिक सक्रियण कम महंगा है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। वर्तमान अध्ययन में, पीएमए + ए 23187 ने एनडी में साइटोकाइन जीन को काफी सक्रिय किया, लेकिन एसएस टी कोशिकाओं को नहीं, यह सुझाव देते हुए कि एसएस टी कोशिकाओं में टीसीआर के डाउनस्ट्रीम में कार्यात्मक कमियां हैं।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल कीमती रोगी-व्युत्पन्न रक्त से फेनोटाइपिक रूप से शुद्ध टी कोशिकाएं प्रदान करता है, और कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति में जीनोम-व्यापी परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि सामान्य CD45RO + T कोशिकाओं की तुलना में एसएस टी कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग सीटीसीएल वाले रोगियों से ताजा मानव टी कोशिकाओं में जीन सक्रियण में गहरा अंतर प्रकट करती है। ये अध्ययन सीटीसीएल में उपन्यास मार्करों को लक्षित करने वाले नैदानिक बायोमार्कर और चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायता करेंगे। इसके अलावा, प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं का अध्ययन करने में यह रणनीति और प्रोटोकॉल अन्य टी सेल मध्यस्थता रोगों के अध्ययन के अनुकूल होने में मूल्यवान हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

नैतिक प्रकटीकरण:
इस शोध प्रोटोकॉल को चिकित्सा विज्ञान (यूएएमएस, लिटिल रॉक, एआर) के लिए अर्कांसस विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था इस अध्ययन में प्रस्तुत माइक्रोएरे डेटा हेनरी फोर्ड अस्पताल (डेट्रायट, एमआई) के आईआरबी द्वारा अनुमोदित अनुसंधान प्रोटोकॉल के तहत भर्ती किए गए नमूनों पर किया गया था।

Acknowledgments

हम उन रोगियों और स्वयंसेवकों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने हमारे शोध में भाग लिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170356
1000 ul Pipet tips VWR 10017-038
15 ml Conical Tubes Corning 352196
25 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170357
5 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170355
50 ml Conical Tubes Thermo Scientific 339652
A23187 ionophore Fisher Scientific BP595
Centrifuge Thermo Scientific 75004381
DMSO Sigma D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit StemCell 19157
FBS GIBCO 16140-071
HBSS GIBCO 14185-052
HEPES Fisher Bioreagents BP310-500
KHCO3 Fisher Bioreagents P184-500
Lymphocyte Separation Medium Corning 25-072-CV
Na2EDTA ACROS 10378-23-1
NaHCO3 Fisher Bioreagents S233-500
NH4Cl Fisher Bioreagents A661-500
Penicillin-streptomycin solution GIBCO 15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA) Sigma P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ RAININ 17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ RAININ 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ RAININ 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ RAININ 17014392
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1013
Rneasy Plus Mini Kit Qiagen 74136
RPMI 1640 GIBCO 31800-022
T-25 Flask Thermo Scientific 2024-10

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Mehdi, S. J., Moerman-Herzog, A. M., … More

Mehdi, S. J., Moerman-Herzog, A. M., Wong, H. K. Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from Sézary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling. J. Vis. Exp. (176), e61470, doi:10.3791/61470 (2021).

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