Summary
Presentert her er en fosfoproteomisk tilnærming, nemlig stoppe og gå ekstraksjon tips basert fosfoproteomisk, som gir høy gjennomstrømning og dyp dekning av Arabidopsis fosfoproteom. Denne tilnærmingen avgrenser oversikten over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Abstract
Proteinfosforylering er avgjørende for regulering av enzymaktivitet og genuttrykk under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserte fosfoproteomics har forvandlet måten å studere anlegget signal transduksjon. Imidlertid har kravet om mange startmaterialer og langvarig MS-måletid for å oppnå dybden av dekning vært den begrensende faktoren for den høye gjennomstrømningsstudien av globale fosfoproteomiske endringer i planter. For å forbedre følsomheten og gjennomstrømningen av plantefosfoproteomics, har vi utviklet en stopp og gå ekstraksjon (stadium) tipsbasert fosfoproteomics tilnærming kombinert med Tandem Mass Tag (TMT) merking for rask og omfattende analyse av plante fosforylering perturbasjon som svar på osmotisk stress. Ved hjelp av enkelheten og den høye gjennomstrømningen av trinnspissteknikk, tar hele prosedyren omtrent en time ved hjelp av to tips for å fullføre fosfoeptidberikelse, fraksjonering og prøverengjøringstrinn, noe som tyder på en brukervennlig og høy effektivitet av tilnærmingen. Denne tilnærmingen gir ikke bare en grundig plantefosfoproteomics analyse (> 11,000 fosfoeptid identifikasjon), men viser også overlegen separasjon effektivitet (< 5% overlapping) mellom tilstøtende fraksjoner. Videre er multipleksing oppnådd ved hjelp av TMT-merking for å kvantifisere fosfoproteomiske endringer av villtype og snrk2 decuple muterte planter. Denne tilnærmingen har med hell blitt brukt til å avsløre fosforyleringshendelsene til Raf-lignende kinaser som svar på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen av tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Introduction
Høy saltholdighet, lav temperatur og tørke forårsake osmotiske påkjenninger, noe som er en viktig miljøfaktor som påvirker planteproduktiviteten1,2. Proteinfosforylering er en av de viktigste post-translasjonelle modifikasjoner mediere signaloppfatning og transduksjon i planterespons på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relatert protein kinase 2s (SnRK2s) er involvert i osmotisk stress signalering6. Ni av ti medlemmer av SnRK2-familien viser betydelig aktivering som svar på osmotisk stress7,8. Snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutert med mutasjoner i alle ti SnRK2 viste overfølsomhet overfor osmotisk stress. I snrk2-dec mutant er den osmotiske stressinduserte akkumuleringen av inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic acid (ABA) biosyntese og genuttrykk sterkt redusert, og fremhever den vitale rollen til SnRK2s i osmotiske stressresponser6. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan SnRK2s kinaser regulerer disse biologiske prosessene. Profilering av fosfoproteomiske endringer som svar på osmotisk stress er en effektiv måte å bygge bro over dette gapet og å avgrense de osmotiske stressutløste forsvarsmekanismene i planter.
Massespektrometri (MS) er en kraftig teknikk for kartlegging av plantefosfoproteom9. Karakterisering av plantefosfoproteomics er imidlertid fortsatt en utfordring på grunn av det dynamiske spekteret av planteproom og kompleksiteten av plantelysat4. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi en universell plantefosfoproteomisk arbeidsflyt, som eliminerer uønskede forstyrrelser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter, og muliggjør dyp dekning av plantefosfoproteom10. Flere fosfoeptidberikelsesmetoder som immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC) og metalloksidkromatografi (MOC) er utviklet for berikende fosfoopeptider før MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-fosfoproeptider samtidig rensing med fosfokleptider er de viktigste forstyrrelsene for fosfoeptiddeteksjon. Tidligere standardiserte vi pH-verdien og organisk syrekonsentrasjon av IMAC-lastbuffer for å eliminere bindingen av ikke-fosfoopeptider, for å oppnå mer enn 90% berikelsespesifisitet som omgår pre-fraksjoneringstrinn11.
Prøvetap i flertrinnsprosessen av fosfoprotidberikelse og fraksjonering hindrer følsomheten til fosfoproeptididentifikasjon og dybden av fosfoproteomisk dekning. Stop-and-go-ekstraksjonsspisser (scenespisser) er pipettespisser som inneholder små disker for å dekke enden av spissen, som kan innlemmes med kromatografi for peptidfraksjon ogrengjøring 17. Prøvetap under trinnspissen kan minimeres ved å unngå prøveoverføring mellom rørene. Vi har implementert scenetips i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC for å skille lav rikelig flere fosforylerte peptider fra enkeltfosforylerte peptider, noe som forbedret dybden av menneskelig fosfoproteom15. I tillegg har bruken av høy pH reversert fase (Hp-RP) stadium tips vist bredere dekning av menneskelig membran proteom sammenlignet med sterk kation utveksling (SCX) og sterk anion utveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integrering av IMAC- og Hp-RP-trinns spissteknikker øke plantefosfoproteomdekningen med enkelhet, høy spesifisitet og høy gjennomstrømning. Vi har vist at denne strategien identifiserte mer enn 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis frøplanter, som representerer en forbedret dybde av plantefosfoproteom19.
Her rapporterer vi en stadium tipsbasert fosfoproteomisk protokoll for fosfoproteomisk profilering i Arabidopsis. Denne arbeidsflyten ble brukt til å studere fosfoproteomisk perturbasjon av villtype og snrk2-des muterte frøplanter som svar på osmotisk stress. Fosfoproteomisk analyse avslørte fosforyleringsstedene som er involvert i kinaseaktivering og tidlig osmotisk stresssignalering. Komparativ analyse av villtype og snrk2-des muterte fosfoproteomdata førte til oppdagelsen av en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade som spiller en nøkkelrolle i osmore stress signalering i høye planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøve forberedelse
- Høst kontrollen og stresset behandlet frøplanter (1 g) i en aluminiumsfolie og flash fryse prøvene i flytende nitrogen.
MERK: Høyere proteinkonsentrasjon observeres vanligvis fra to uker gamle frøplanter enn fra modne planter. Ett gram frøplanter genererer ca 10 mg proteinlylat, noe som er nok for MS-analysen. Alle sentrifugeringstrinn finner sted ved 16 000 x g i trinn 1. - Grind frosne frøplanter i et fint pulver ved hjelp av en mørtel og pestle fylt med flytende nitrogen.
- Tilsett 1 ml lysisbuffer ((6 M guanidin-HCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) med 10 mM Tris (2-karboksyetyl)Fosfinhydroklorid (TCEP), 40 mM 2-kloroacetamid (CAA), proteasehemmer og fosfatasehemmercocktailer) til mørtelen og bland ved hjelp av pestle.
- Overfør planten lysate til et 1,5 ml rør og varme ved 95 °C i 5 min.
- Plasser røret på isen i 10 min. Sonicate røret på isen i 10 s, pause for 10 s, og gjenta tre ganger.
- Sentrifuger røret i 20 min og aliquot 150 μL plantelysat i et 1,5 ml rør.
- Tilsett 600 μL på 100% metanol i røret. Vortex og spinne ned røret.
- Tilsett 150 μL 100% kloroform i røret. Vortex og spinne ned røret.
- Tilsett 450 μL ddH2O i røret. Vortex og sentrifuger røret i 3 min.
- Kast det øvre vandige laget. Tilsett 600 μL på 100% metanol i røret. Sentrifuger røret i 3 min og kast deretter oppløsningen.
- Vask proteinpellets med 600 μL på 100% metanol. Kast oppløsningen og lufttørk proteinpelleten.
- Gjenbruk proteinpellets i 600 μL fordøyelsesbuffer (12 mM natrium deoxycholate (SDC)/12 mM natrium lauroyl sarcosinate (SLS) i 100 mM Tris-HCl, pH 8.5). Sonicate røret til suspensjonen er homogenisert.
- Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et BCA-sett og juster konsentrasjonen til 4 μg/μL med fordøyelsesbufferen. Overfør 100 μL av lysatet (400 μg proteiner) til et nytt rør.
- Tilsett 292 μL på 50 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB) og 8 μL Lys-C (2,5 enhet/ml) på røret. Inkuber røret ved 37 °C i 3 timer.
- Tilsett 100 μL μL 50 mM TEAB med 8 μg trypsin til røret. Inkuber røret ved 37 °C i 12 timer.
- Tilsett 25 μL med 10 % trifluoreaketisk syre (TFA) i røret. Vortex og sentrifuger røret i 20 min ved 4 °C.
- Overfør det overnaturante til en betinget desaltingskolonne for avsalting. Tørk eluat ved hjelp av en vakuum sentrifuge konsentrator.
MERK: Aktiver harpiksen med 1 ml metanol etterfulgt av 1 ml 0,1 % TFA i 80 % acetonitril (ACN). Vask ut det organiske oppløsningsvæsket med minst 3 ml 0,1 % TFA i 5 % ACN. Last forsuret peptidprøver tilberedt i trinn 1,16 inn i kolonnen og vask deretter kolonnen med minst 3 ml 0,1% TFA i 5% ACN. Flere vasker kan være nødvendig for prøver med høye saltkonsentrasjoner. Elute fosfoopeptidene med 1 ml 0,1 % TFA i 80 % ACN.
2. Merking av tandemmassemerke (TMT)
- Bruk de tørkede peptidene til 100 μL på 200 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinethanesulfonic acid (HEPES), pH 8.5.
- Oppløs TMT-reagensen for hver kanal (0,8 mg) i 40 μL vannfri ACN. Vortex TMT reagensrøret i 5 min og spinn det ned.
- Overfør 40 μL TMT til prøverøret og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
MERK: I dette eksperimentet ble kanalen 126 til 128 merket med tre biologiske repliker av planter uten mannitolbehandling, og kanalen 129 til 131 ble merket med tre biologiske repliker av planter med mannitolbehandling. - Tilsett 8 μL 5 % hydroksylamin og inkuber i 15 min.
- Bland 6 prøver i et 5 ml rør og tilsett 14 μL på 10% TFA.
- Tilsett 3876 μL på 0,1 % TFA i røret. Vortex og spinne ned.
- Overfør løsningen til en betinget avsaltingskolonne for avsalting. Tørk eluatet med en fordamper.
3. Fremstilling av IMAC-scenespiss
- Bruk en 16 G stump kanyle til å trenge inn i en polypropylenfritst.
MERK: Hold kniven vinkelrett på overflaten på disken, og rull kniven et par ganger for å forsikre deg om at disken er fullstendig utskåret. Plasser disken i en petriskål for lagring. Plasser nålen i en pipettespiss på 200 μL, og skyv friten inn i tuppen med et stempel. - Trykk friten forsiktig inn i tuppen med et stempel for å toppe enden av spissen.
- Plasser frit disken i tips med samme trykk, noe som gir bedre reproduserbarhet. Reproduserbarheten av trinn tips produksjon er viktig for konstant tilbaketrykk, noe som påvirker tidspunktet for sentrifuge trinn og reproduserbarhet mellom tekniske repliker.
- Hvis scenetipsene viser høyt ryggtrykk under kondisjoneringstrinn, kast tuppene for å unngå potensiell tupptilstopping når du laster inn prøver. Det kan være at disken kan ha blitt presset for hardt på plass.
- Inverter Ni-NTA spin-kolonne og plasser på et 1,5 ml rør.
- Bruk et stempel til å trykke frit av Ni-NTA perler forsiktig og skyv perlene inn i røret.
MERK: Sørg for å skyve friten forsiktig for å unngå det potensielle perletapet eller adsorpsjonen på spin-kolonnen.
4. Klargjøring av Hp-RP-scenespiss
- Klargjør hp-rp-trinnspissen som beskrevet for IMAC-scenespissen ved hjelp av en C8-disk.
MERK: Ikke bruk stor kraft på disken fordi det kan føre til en tettpakket frit og øke ryggtrykket på scenespissen. Alle sentrifugeringstrinn finner sted ved 1000 x g i 5 min i trinn 4. - Suspender 1 mg C18 perler i 100 μL 100% metanol og send perlene løsning gjennom spissen.
- Tilsett 20 μL buffer 8 (80 % ACN/20 % 200 mM NH4HCO2,pH 10,0) i trinnspissen og send buffer 8 gjennom spissen ved sentrifugering.
- Tilsett 20 μL buffer A (200 mM NH4HCO2)i trinnspissen og send buffer A gjennom spissen ved sentrifugering.
MERK: Balanser sentrifugen under bruk og kontroller at Hp-RP-scenespissen ikke er helt tørket.
5. Tilberedning av spin adapter
- Bruk skarpe end pinsett for å punktere et hull i midten av lokket på et 1,5 ml rør.
- Sett IMAC-trinnspissen eller Hp-RP-scenespissen inn i hullet på spin-adapteren.
MERK: Kontroller at scenespissen ikke er i nærheten av bunnen av spin adapteren.
6. Fosfobetidberikelse ved hjelp av IMAC-scenespiss
- Suspender 10 mg Ni-NTA perler med 400 μL lastbuffer (6% eddiksyre (AA), pH 3.0) og last alle perlene løsning i per tupp. Før løsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
MERK: Alle sentrifugeringstrinn finner sted ved 200 x g i 3 min i trinn 6 i tillegg til trinn 6.8. - Last 100 μL på 50 mM etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) for å fjerne nikkelionene fra IMAC-scenespissen og passere løsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
- Legg 100 μL lastbuffer til scenespissen og send løsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
- Legg 100 μL på 50 mM FeCl3 i 6 % AA til scenespissen og før oppløsningen gjennom spissen ved sentrifugering. Fe3 + ioner vil chelate til IMAC scenen tips.
- Legg i 100 μL lastbuffer for å balsamere scenespissen og før oppløsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
- Legg 100 μL lastbuffer med prøvepeptider tilberedt i trinn 2,7 til scenespissen og send løsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
MERK: Ta med et nytt rør som spinnadapter for å samle gjennomstrømningen av prøven og lagre gjennomstrømningen i fryseren for fremtidig analyse. - Legg 100 μL vaskebuffer (4,5 % AA og 25 % ACN) til scenespissen og før oppløsningen gjennom spissen ved sentrifugering.
- Utfør den andre vasken med lastbuffer. Legg 100 μL lastbuffer til scenespissen og send oppløsningen gjennom spissen ved hjelp av 1000 × g sentrifuge i 3 min.
MERK: Kontroller at vaskebufferen skiftes ut ved å laste bufferen i scenespissen for å eliminere tap av fosfoproeptider under elution-trinnet. Likevekt i IMAC-stadiumspissen før fosfoproeptideuttoning for å sikre at konsentrasjonen av ACN er under 5 %. - Trim IMAC-scenespissen foran med en saks og plasser den trimmede IMAC-scenespissen inne i Hp-RP-spissen. Pass på at de to lagene med scenespisser ikke berører lokket på sentrifugen.
7. Fosfobetidfraksjon ved hjelp av Hp-RP C18-trinnspissen
- Tilsett 100 μL elutionbuffer (200 mM ammoniumfosfat (NH4H2PO4)) til den trimmede IMAC-scenespissen og send løsningen gjennom de to lagene med scenespisser ved sentrifugering.
MERK: Hvis oppløsningen ikke passerer gjennom scenespissen, øker du hastigheten på spinnet ned. Alle sentrifugeringstrinn finner sted ved 1000 x g i 5 min i trinn 7. Alle Hp-RP-bufferne er oppført i tabell 1. - Kast IMAC-scenespissen med en pinsett og tilsett 20 μL buffer A på Hp-RP-scenespissen og send bufferen gjennom spissen ved sentrifugering.
MERK: Kontroller at all elutionbufferen passerer gjennom IMAC-stadiespissen før du kaster den. - Tilsett 20 μL buffer 1 for å elute fraksjon 1 og samle eluatet i et nytt rør ved sentrifugering. Gjenta prosessen med Buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 for å samle hver brøkdel i et nytt rør. Tørk den endelige eluate av hver brøkdel ved hjelp av en vakuumkonsentrator.
MERK: Klargjør buffere for ny fraksjonering. Ta 8 nye rør som spinnadapter for hver brøkdel. Samle eluatet av hver brøkdel i en annen spinnadapter. Fosfoopeptider er ikke stabile under grunnleggende forhold, så tørk eluatene av en konsentrator eller surgjort med 10% TFA umiddelbart.
8. LC-MS/MS analyse og dataanalyse
- Tilsett 5 μL 0,1 % maursyre (FA) og analyser prøven med et massespektrometer.
- Kjør en 90 min gradient med 6-30% buffer B (80% ACN og 0,1% FA) for hver brøkdel.
- Fragmenter de 10 beste merkede peptidene ved hjelp av høy kollisjonsenergidissosiasjon (HCD). Fullfør et databasesøk for å identifisere fosforyleringsområder.
- Last inn raw-filene i MaxQuant-programvaren, navngi eksperimentene og angi brøker og PTM.
MERK: Opplæringen av MaxQuant programvare finner du på https://www.maxquant.org/. - Velg reporter ion MS2 i typen LC-MS/MS run og 6plex TMT som isobariske etiketter. Aktiver filter etter PIF-funksjonen og still inn min PIF som 0,75.
- Velg Acetyl (Protein N-term), Oksidasjon (M) og Fosfo (STY) til panelet med variable modifikasjoner. Velg Karbamidometylen (C) som faste modifikasjoner.
- Angi fordøyelsesmodus som spesifikk, velg Trypsin /P som fordøyelsesenzym, og to tapte spalting.
- Sett PSM falsk oppdagelseshastighet (FDR) og protein FDR som 0,01. Angi minimumspoengsummen for modifiserte peptider som 40.
- Legg Arabidopsis thaliana database til panelet av fasta filer og kjøre databasesøk.
- Last txt-filen til Phospho (STY) nettsteder til Perseus programvare som søket er gjort.
MERK: De detaljerte veiledningene i Perseus-programvaren finner du på https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtrer ut de omvendte fosforyleringsstedene. Filtrer ut de ikke-lokaliserte fosforyleringsstedene ved hjelp av lokaliseringssannsynlighet 75 % som cut-off.
- Bruk intensiteten av fosforyleringssteder for statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere ytelsen til denne arbeidsflyten, utnyttet vi IMAC-scenetips kombinert med Hp-RP-stadietippfraksjon for å måle fosfoproteomiske endringer i villtype og snrk2-des muterte frøplanter med eller uten mannitolbehandling i 30 minutter. Hver prøve ble utført i biologiske triplikater, og den eksperimentelle arbeidsflyten er representert i figur 1. De fordøyde peptidene (400 μg) av hver prøve ble merket med en TMT-6plex kanal, samlet og avsaltet. Fosfoopeptidene ble ytterligere beriket ved hjelp av en IMAC-scenespiss, og de rensede fosfoproduene ble senere fraksjonert til åtte fraksjoner av en Hp-RP-scenespiss. Hver brøkdel ble analysert av en 90 min LC gradient analyse. Råfilene ble søkt ved hjelp av en søkemotor mot Arabidopsis thaliana database.
Totalt 11 077 unike fosforyler ble identifisert tilsvarende 3630 fosfoproteiner med 6852 lokaliserte fosforyleringssteder (klasse I, lokaliseringssannsynlighet > 0,75), noe som indikerer den brede dekningen av Arabidopsis fosfoproteom. Totalt ble det identifisert 8107 og 7248 fosfoproducider fra mutertprøve av villtype og snrk2-des. Dette illustrerer effektiviteten av arbeidsflyten i å gi grundig dekning for avgrensing av det globale synet på signaltransduksjon i Arabidopsis. Vi sammenlignet antall identifiserte fosfoproduser over 8 fraksjoner. Noen fosforeptider ble identifisert i de to første brøkene, fraksjon 1 og 2. Imidlertid ble flertallet av fosfoproeptider jevnt fordelt i resten 6 fraksjoner (figur 2A), noe som tyder på at denne tilnærmingen gir evnen til å skille komplekse fosfoproeptider fra plantefosfoproteom. For ytterligere å demonstrere separasjonseffektiviteten til denne arbeidsflyten evaluerte vi overlappingen av fosfoproeptider mellom to tilstøtende fraksjoner (eq. F1-til-F2). Mindre enn 5 % fosfoprodus overlapper i de tilstøtende brøkene, noe som indikerer robust fraksjoneringseffektivitet for Hp-RP-stadiet (figur 2B).
Ved hjelp av dataene innhentet av arbeidsflyten sammenlignet vi fosfoproteomiske profiler av villtype og snrk2-dec mutant ved mannitolbehandling. Totalt 433 og 380 fosforyleringssteder ble økt etter mannitolbehandling i mutertprøve av villtype og snrk2 des (figur 3). Blant dette viste 312 fosfositter induksjon (FDR < 0,01) i villtype, men ikke i snrk2-des muterte planter. Gene Ontology (GO)-analysen viste at funksjonen av fosforylering og aktivering av proteinkinase, regulering av fosfat metabolsk prosess, signaltransduksjon, er betydelig beriket i SnRK2-avhengige fosfoproteiner. Interessant, GO begrepet knyttet til rotutvikling ble også beriket i SnRK2-avhengig gruppe, i samsvar med fenotypen av rotvekst retardasjon under osmotisk stress6. Vi identifiserte også 116 fosfositter up-regulert av mannitolbehandling i både villtype og snrk2-des mutant. Disse fosfoproteinene var uavhengige av SnRK2, eller kandidater som megler osmotisk stressutløst signalisering før SnRK2s aktivering. Vi observerte at flere B4-undergruppeRAFer som RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) og RAF42 (AT3G46920) var betydelig oppregulert av osmotisk stress. Videre studier viste at RAF kinaser er raskt aktivert av osmotisk stress og kreves for fosforylering og aktivering av SnRK2s20.
Figur 1: Arbeidsflyt for stadium tipsbasert fosfoproteomisk metode. Protein ble ekstrahert og fordøyd fra villtype og snrk2-des muterte frøplanter behandlet med eller uten mannitol. De fordøyde peptidene til hver replikering ble merket med en unik TMT6-plex kanal. Fosfoopeptider ble samlet og deretter beriket ved hjelp av en IMAC-scenespiss. De rensede fosfoopeptidene ble separert av en Hp-RP-scenespiss. Hver brøkdel ble analysert av massespektrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fosfoproteomisk profilering av villtype og snrk2 decuple mutant frøplanter av IMAC-scenespiss og Hp-RP-fraksjonering. (A)Antall identifiserte fosfoproduser per brøk. (B)Separasjonseffektiviteten til trinnspissenbasert Hp-RP-kromatografi. Overlappingen mellom de tilstøtende brøkene representeres av prosentandelen av det samme peptidet som er identifisert i de tilstøtende brøkene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av fosfoproteomiske endringer som svar på osmotisk stress. Vulkantomter viser log2 fold endring av fosforylering steder i (A) vill-type og (B) snrk2-des mutant frøplanter som svar på mannitol behandling. Den svarte sirkelen representerer kinasefosforyleringssteder indusert av mannitol. Den røde sirkelen indikerer fosforyleringsstedene til RAFs oppregulert som svar på mannitol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer A | 200 mM ammoniumformat (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Buffer B | 100% ACN. | |
| Buffer 1 | 5% Buffer B, 95% Buffer A. | |
| Buffer 2 | 8% Buffer B, 92% Buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% Buffer B, 89% Buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% Buffer B, 86% Buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% Buffer B, 83% Buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% Buffer B, 80% Buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% Buffer B, 77% Buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% Buffer B, 20% Buffer A. | |
Tabell 1: Buffere for fraksjon av Hp-RP-trinntips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det dynamiske området og kompleksiteten til planteproom og fosfoproteom er fortsatt en begrensende faktor for dybden av fosfoproteomics analyser. Til tross for muligheten for enkeltkjøring LC-MS / MS analyse for å identifisere 10.000 fosforyleringnettsteder 21,22,dekningen av hele anlegget fosfoproteom er fortsatt begrenset. Derfor er det nødvendig med en fosfoproteomisk arbeidsflyt som gir høy følsomhet og overlegen separasjonseffektivitet for å profilere det globale synet på plantesignalnettverk som svar på miljøstress. Kommersiell høytrykks væskekromatografi (HPLC) kolonnebasert kromatografi er en vanlig metode for å redusere peptidkompleksiteten før MS-analyse23,24. Kjedelige prøveinnsamlingstrinn og stort elutionvolum er imidlertid de store utfordringene ved HPLC-baserte metoder når det gjelder følsomhet og gjennomstrømming. trinn tips er en alternativ tilnærming til å utføre peptid pre-fraksjonering eller berikelse for høy følsomhet og høy gjennomstrømning fungerer. Denne nye fosfoproteomiske arbeidsflyten som utnytter isobar merking kombinert med fosfoprotidberikelse og fraksjonering gir bedre dekning og dybde av plantefosfoproteomics over andre fosfoproteomiskearbeidsflyter 25,26.
PH-verdien av prøver er den avgjørende faktoren som bestemmer berikelsespesifisiteten til fosfoproducider. PH-verdien kan påvirkes av forrige trinn i prøveklargjøringen, så det er viktig å kontrollere pH-verdien før prøveinnlasting. Hvis pH flyttes, tilsett eddiksyre eller natriumhydroksid til prøver for å justere pH til 3,0. Vi utfører denne protokollen for samtidig elitning og lasting av fosfoprodusid på C18-trinnspissen. Derfor er det viktig å likevekte IMAC-stadiet før fosfoproeptideution for å sikre at konsentrasjonen av ACN er under 5 %.
Antall brøker er avhengig av kompleksiteten og utvalgsstørrelsene. Vanligvis er 5 til 8 fraksjoner nok til å gi bred dekning av fosfoeptididentifikasjon i planter. Konsentrasjonen av ACN i fraksjoneringsbuffere kan justeres i henhold til hydrofobicity av prøver. De fleste fosfoopeptider er eluted fra C18 perler ved hjelp av området 5% til 25% ACN konsentrasjon. Fosfoproeptider er vanligvis mer hydrofile sammenlignet med ikke-fosforylerte peptider på grunn av de ekstra negative kostnadene for fosfatgruppen. Merking av TMT-reagens på N-endestasjon for peptid fører imidlertid til en økning av hydrofobicity av merkede peptider27, som kan forklare hvorfor færre fosfoopeptider ble identifisert i de to første brøkene i vårt tilfelle (figur 2A). Dermed kan en test ved hjelp av en TMT-null reagens og en aliquot av prøver brukes til å evaluere antall brøker og ACN-konsentrasjonen i hver fraksjoneringsbuffere. De optimaliserte bufferne kan føre til bedre separasjonseffektivitet av TMT-6plex merkede fosfoprodusider.
Begrensningene for trinntipsbasert fraksjonering er antall brøker og kapasiteten til tips. Det er vanskelig å utvide antall brøker i stadiet tips separasjon fordi diskontinuerlige gradient buffere brukes for stadium tips fraksjonering. På den annen side kan en kontinuerlig gradering brukes på HPLC-kolonner for å oppnå et høyt brøknummer. Kapasiteten til tips er en annen faktor som begrenser anvendelsen av scenetips. For storskala fosfoproteomics analyse (> 10 mg proteiner) er det bedre å bruke HPLC-basert berikelse med lengre kolonnelengde fullpakket med flere C18 perler og fraksjonering, som er utenfor den analytiske skalaen av scenespisser. Samlet sett er stadium tip-basert fosfobetidberikelse og fraksjonering en nyttig metode for små til mellomstore skala av fosfoproteomics analyser. Denne tilnærmingen kan integreres med isobar merking for å oppnå multipleksed kvantifisering. Resultatene viste også at det kunne brukes til grundig plantefosfoproteomics profilering og kvantifisering. Denne arbeidsflyten gjelder for andre arter og ulike vevstyper for avgrensning av spesialiserte signalnettverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Strategic Priority Research Program fra Det kinesiske vitenskapsakademiet, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
