Summary
Præsenteret her er en fosforproteomic tilgang, nemlig stop og gå udvinding tip baseret fosforproteomic, som giver høj-gennemløb og dyb dækning af Arabidopsis fosforproteome. Denne tilgang afgrænser overblikket over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Abstract
Proteinphosphorylering er afgørende for reguleringen af enzymaktivitet og genekspression under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserede fosforproteomics har ændret måden at studere plantesignaltransduktion på. Kravet om masser af råvarer og forlænget MS-målingstid for at opnå dækningsdybden har imidlertid været den begrænsende faktor for den høje gennemstrømningsundersøgelse af globale fosforprotemiske ændringer i planter. For at forbedre følsomheden og gennemstrømningen af plantephosphoproteomics har vi udviklet en stop and go-ekstraktion (fase) spidsbaseret fosforproteomics-tilgang kombineret med Tandem Mass Tag (TMT) mærkning til hurtig og omfattende analyse af plantephosphoryleringsengturbation som reaktion på osmotisk stress. Ved at udnytte enkelheden og den høje gennemløb af fasespidsteknikken tager hele proceduren cirka en time at bruge to spidser til at afslutte fosforberigelse, fraktionering og prøverensningstrin, hvilket tyder på en brugervenlig og høj effektivitet af tilgangen. Denne fremgangsmåde giver ikke kun en dybdegående plantephoosphoproteomics-analyse (> 11.000 fosforidentifikation), men viser også den overlegne adskillelseseffektivitet (< 5% overlapning) mellem tilstødende fraktioner. Desuden er multipleksering opnået ved hjælp af TMT-mærkning for at kvantificere fosforprotemiske ændringer af vilde og snrk2 decuple mutantplanter. Denne tilgang er med succes blevet brugt til at afsløre fosforyleringshændelserne i Raf-lignende kinases som reaktion på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen af tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Introduction
Høj saltholdighed, lav temperatur og tørke forårsager osmotiske belastninger, som er en vigtig miljøfaktor, der påvirker planteproduktivitet1,2. Proteinphosphorylering er en af de mest betydningsfulde ændringer efter oversættelsen , der formidler signalopfattelse og transduktion i anlæggets reaktion på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relateret protein kinase 2s (SnRK2s) er involveret i den osmotiske stress signalering6. Ni af ti medlemmer af SnRK2 familien viser betydelig aktivering som reaktion på osmotisk stress7,8. Den snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant har mutationer i alle ti SnRK2 vises overfølsomhed over for osmotisk stress. I snrk2-dec mutant, den osmotiske stress-induceret ophobning af inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3), abscissyre (ABA) biosyntese, og genekspressioner er stærkt reduceret, fremhæver den afgørende rolle SnRK2s i osmotisk stressrespons6. Det er dog stadig uklart, hvordan SnRK2s kinases regulerer disse biologiske processer. Profilering af fosforprotemomic ændringer som reaktion på osmotisk stress er en effektiv måde at bygge bro over denne kløft og til at afgrænse osmotiske stress-udløste forsvarsmekanismer i planter.
Massespektrometri (MS) er en effektiv teknik til kortlægning af plantephoproteome9. Karakterisering af plantephosphoproteomics er imidlertid fortsat en udfordring på grund af det dynamiske udvalg af planteproteom og kompleksiteten af plante lysat4. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi en universel plantephoproteomic arbejdsgang, som eliminerer uønskede interferenser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter og muliggør den dybe dækning af plantefosforproteome10. Der er udviklet flere fosforberigelsesmetoder såsom immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC) og metaloxidkromatografi (MOC) til berigelse af fosforider forud for MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-phosphopeptider, der er medrensende med fosfortider, er de største interferenser for fosfordetektion. Tidligere har vi standardiseret pH-værdien og koncentrationen af organisk syre i IMAC-belastningsbuffer for at eliminere bindingen af ikke-phosphopeptider for at opnå mere end 90% berigelse specificitet uden om præfraktionstrin11.
Prøvetab i flertrinsprocessen for fosforberigelse og fraktionering hæmmer fosforidentifikationens følsomhed og dybden af fosforprotemisk dækning. Stop-and-go-ekstraktionsspidser (trinspidser) er pipettespidser, der indeholder små diske til at lægge låg på enden af spidsen, som kan indarbejdes med kromatografi til peptidfraktionering og rengøring17. Prøvetab under fasespidsproceduren kan minimeres ved at undgå prøveoverførsel mellem rørene. Vi har med succes implementeret fase tip i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC at adskille lav rigelige flere fosforitilerede peptider fra enkeltvis phosphorylated peptider, som forbedrede dybden af menneskelige fosforeom15. Desuden har brugen af høj pH-bakfase (Hp-RP) trinspids vist den bredere dækning af humanmembran proteom sammenlignet med stærk kation udveksling (SCX) og stærk anion udveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integration af IMAC- og Hp-RP-scenespidsteknikker øge plantens fosforproteome-dækning med enkelhed, høj specificitet og høj gennemløb. Vi har vist, at denne strategi identificerede mere end 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis-frøplanter, hvilket repræsenterer en forbedret dybde af plantephoproteome19.
Her rapporterer vi en fase tip-baseret fosforproteomic protokol for fosforproteomic profilering i Arabidopsis. Denne arbejdsgang blev anvendt til at studere fosforproteomic forstyrrelse af vilde-type og snrk2-dec mutant kimplanter som reaktion på osmotisk stress. Fosforproteomic analyse afslørede fosforylering steder impliceret i kinase aktivering og tidlig osmotisk stress signalering. Sammenlignende analyse af wild-type og snrk2-dec mutant phosphoproteome data førte opdagelsen af en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade, som spiller en central rolle i osmore stress signalering i høje planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- De kontrol- og stressbehandlede frøplanter (1 g) høstes i en aluminiumsfolie, og prøverne fryses i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Højere proteinkoncentration observeres normalt fra to uger gamle frøplanter end fra modne planter. Et gram frøplanter genererer ca. 10 mg protein lysat, hvilket er nok til MS-analysen. Alle centrifugeringstrin finder sted ved 16.000 x g i trin 1. - Grind frosne frøplanter i et fint pulver ved hjælp af en mørtel og støder fyldt med flydende nitrogen.
- Der tilsættes 1 ml lysisbuffer ((6 M guanidin-HCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) med 10 mM Tris (2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 40 mM 2-chloracetamid (CAA), proteaseinhibitor og fosfatasehæmmercocktails) til mørtel og blandes ved hjælp af pestle.
- Anlæggets lysat overføres til et 1,5 mL rør og opvarmes ved 95 °C i 5 min.
- Placer røret på is i 10 minutter. Sonicate røret på is i 10 s, pause i 10 s, og gentag tre gange.
- Røret centrifuges i 20 min. og aliquot 150 μL plantens lysat i et 1,5 mL rør.
- Der tilsættes 600 μL på 100% methanol i røret. Vortex og spin ned i røret.
- Der tilsættes 150 μL på 100% kloroform i røret. Vortex og spin ned i røret.
- Der tilsættes 450 μL ddH2O i røret. Vortex og centrifuge røret i 3 min.
- Kassér det øverste vandige lag. Der tilsættes 600 μL på 100% methanol i røret. Centrifuge røret i 3 min og derefter kassere opløsningen.
- Vask proteinpiller med 600 μL på 100% methanol. Opløsningen kasseres, og proteinpillen lufttørres.
- Resuspend proteinpiller i 600 μL fordøjelsesbuffer (12 mM natrium deoxycholat (SDC)/12 mM natrium lauroyl sarcosinat (SLS) i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sonicate røret, indtil suspensionen er homogeniseret.
- Proteinkoncentrationen måles ved hjælp af et BCA-sæt, og koncentrationen justeres til 4 μg/μL med fordøjelsesbufferen. 100 μL af lysatet (400 μg proteiner) overføres til et nyt rør.
- Der tilsættes 292 μL på 50 mM triethylammoniumbicarbonat (TEAB) og 8 μL Lys-C (2,5 enhed/mL) til røret. Røret inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Der tilsættes 100 μL på 50 mM TEAB med 8 μg trypsin til røret. Røret inkuberes ved 37 °C i 12 timer.
- Der tilsættes 25 μL 10% trifluordikesyre (TFA) til røret. Vortex og centrifuge røret i 20 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til en betinget afsaltningskolonne til afsaltning. Eluatet tørres ved hjælp af en vakuumcentrifugekoncentrator.
BEMÆRK: Aktiver harpiksen med 1 ml methanol efterfulgt af 1 ml 0,1% TFA i 80% acetonitrofol (ACN). Det organiske opløsningsmiddel vaskes ud med mindst 3 mL på 0,1% TFA i 5% ACN. Sure peptidprøver, der er fremstillet i trin 1.16, indlæses i kolonnen, og kolonnen vaskes derefter med mindst 3 mL på 0,1% TFA i 5% ACN. Der kan være behov for flere vaske til prøver med høje saltkoncentrationer. Elute phosphopeptider med 1 mL på 0,1% TFA i 80% ACN.
2. Mærkning af Tandem Mass Tag (TMT)
- De tørrede peptider opsanvendes til 100 μL på 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES), pH 8,5.
- TMT-reagenset opløses for hver kanal (0,8 mg) i 40 μL vandfri ACN. Vortex TMT reagensrøret i 5 minutter og drej det ned.
- 40 μL TMT overføres til prøveglasset og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: I dette forsøg var kanal 126 til 128 mærket med tre biologiske replikater af planter uden mannitolbehandling, og kanal 129 til 131 var mærket med tre biologiske replikater af planter med mannitolbehandling. - Der tilsættes 8 μL 5% hydroxylamin og inkuberes i 15 min.
- 6 prøver blandes i et 5 mL rør og tilsættes 14 μL af 10% TFA.
- Der tilsættes 3.876 μL på 0,1% TFA til røret. Vortex og spin ned.
- Overfør opløsningen til en betinget afsaltningskolonne til afsaltning. Tør eluatet ved hjælp af en fordamper.
3. Forberedelse af IMAC-etapetip
- Brug en 16 G stump-ended nål til at trænge ind i en polypropylen frit disk.
BEMÆRK: Hold fræseren vinkelret på diskens overflade, og rul fræseren et par gange for at sikre, at disken er helt fjernet. Placer disken i en petriskål til opbevaring. Sæt nålen i en 200 μL pipettespids, og skub friten ind i spidsen ved hjælp af et stempel. - Tryk friten forsigtigt ind i spidsen ved hjælp af et stempel for at sætte hætten på enden af spidsen.
- Placer frit disk i tips med samme tryk, hvilket giver bedre reproducerbarhed. Reproducerbarheden af fasespidsproduktion er vigtig for konstant modtryk, hvilket påvirker timingen af centrifugetrinnene og reproducerbarheden mellem tekniske replikater.
- Hvis scenetipsene viser højt modtryk under konditioneringstrin, skal du kassere spidserne for at undgå potentiel tipstopning, når du lægger prøver. Det kan være, at disken kan være blevet trykket for hårdt på plads.
- Inverter Ni-NTA spin kolonne og sted på en 1,5 mL rør.
- Brug en stemplet til at trykke frit af Ni-NTA perler forsigtigt og skubbe perlerne ind i røret.
BEMÆRK: Sørg for at skubbe frit forsigtigt for at undgå det potentielle perletab eller adsorption på spinkolonnen.
4. Forberedelse af hp-RP fase tip
- Forbered Hp-RP-fasetippet som beskrevet for IMAC-scenetip ved hjælp af en C8-disk.
BEMÆRK: Påfør ikke stor kraft på disken, da det kan resultere i en tætpakket frittte og øge bagtrykket på scenespidsen. Alle centrifugeringstrin finder sted ved 1.000 x g i 5 min. i trin 4. - 1 mg C18-perler suspenderes i 100 μL 100% methanol, og perlerne føres gennem spidsen.
- Der tilsættes 20 μL buffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10,0) til scenespidsen og passerer buffer 8 gennem spidsen ved centrifugering.
- Der tilsættes 20 μL buffer A (200 mM NH4HCO2) til trinspidsen og passerer buffer A gennem spidsen ved centrifugering.
BEMÆRK: Afbalancer centrifugen under brug, og sørg for, at hp-RP-trinspidsen ikke tørres helt.
5. Klargøring af spinadapter
- Brug skarpe ende pincet til at punktere et hul i midten af låget af en 1,5 mL rør.
- Sæt IMAC-scenespidsen eller Hp-RP-scenespidsen i hullet på spinadapteren.
BEMÆRK: Sørg for, at scenespidsen ikke er tæt på bunden af spinadapteren.
6. Fosforbering ved hjælp af IMAC-trinspids
- Ni-NTA-perlerne på 10 mg med 400 μL læssebuffer (6% eddikesyre (AA), pH 3.0) suspenderes, og alle perlerne hældes i pr. spids. Gennem spidsen føres opløsningen ved centrifugering.
BEMÆRK: Alle centrifugeringstrin finder sted ved 200 x g i 3 min. i trin 6 udover trin 6.8. - 100 μL μL 50 mM ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) for at fjerne nikkelionerne fra IMAC-trinspidsen og føre opløsningen gennem spidsen ved centrifugering.
- 100 μL læssebufferen indlæses på trinspidsen, og opløsningen føres gennem spidsen ved centrifugering.
- 100 μL på 50 mM FeCl3 i 6% AA indlæses på trinspidsen, og opløsningen føres gennem spidsen ved centrifugering. Fe3 + ioner vil chelat til IMAC fase tip.
- 100 μL læssebuffer skal belastes for at konditionere scenespidsen og føre opløsningen gennem spidsen ved centrifugering.
- 100 μL læssebufferen indlæses med prøvepeptider, der er tilberedt i trin 2.7, på trinspidsen, og opløsningen føres gennem spidsen ved centrifugering.
BEMÆRK: Tag et nyt rør som en spinadapter for at indsamle gennemstrømningen af prøven og opbevare flow-through i fryseren til fremtidig analyse. - 100 μL vaskebuffer (4,5% AA og 25% ACN) indlæses på scenespidsen, og opløsningen føres gennem spidsen ved centrifugering.
- Udfør den anden vask med læssebuffer. 100 μL læssebufferen læsses på trinspidsen, og opløsningen føres gennem spidsen med 1000 × g centrifuge i 3 min.
BEMÆRK: Sørg for, at vaskebufferen erstattes af læssebuffer i scenespidsen for at eliminere tab af fosforptider under elueringstrinnet. Ekvilibrere IMAC-trinspidsen inden fosforudsning for at sikre, at koncentrationen af ACN er under 5%. - Trim IMAC-scenespidsen foran med en saks, og placer den trimmede IMAC-scenespids inde i Hp-RP-spidsen. Sørg for, at de to lag af scenespidser ikke rører låget på centrifuge.
7. Fosforfraktion ved hjælp af Hp-RP C18-trinsspids
- Der tilsættes 100 μL elueringsbuffer (200 mM ammoniumphosphat (NH4H2PO4))til den trimmede IMAC-trinspids, og opløsningen føres gennem de to lag scenespidser ved centrifugering.
BEMÆRK: Hvis opløsningen ikke passerer gennem trinspidsen, skal du øge hastigheden på spin down. Alle centrifugeringstrin finder sted ved 1.000 x g i 5 min. i trin 7. Alle Hp-RP-buffere er angivet i tabel 1. - IMAC-trinspidsen kasseres ved hjælp af en pincet, og 20 μL buffer A til hp-RP-trinspidsen tilsættes, og bufferen føres gennem spidsen ved centrifugering.
BEMÆRK: Sørg for, at al elueringsbufferen passerer gennem IMAC-trinspidsen, før den kasseres. - Der tilsættes 20 μL buffer 1 til elutefraktion 1, og eluatet opsamles i et nyt rør ved centrifugering. Gentag processen med Buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 for at samle hver brøk i et nyt rør. Tør den endelige eluat af hver fraktion ved hjælp af en vakuumkoncentrator.
BEMÆRK: Forbered friske fraktioneringsbuffere. Tag 8 nye rør som spinadapter for hver fraktion. Saml eluatet for hver fraktion i en anden spinadapter. Phosphopeptider er ikke stabile under grundlæggende forhold, så tør eluaterne med en koncentrator eller syrnet med 10% TFA straks.
8. LC-MS/MS-analyse og dataanalyse
- Der tilsættes 5 μL 0,1% myresyre (FA), og prøven analyseres med et massespektrometer.
- Kør en 90 min gradient med 6-30% buffer B (80% ACN og 0,1% FA) for hver brøk.
- Fragmenter de øverste 10 mærkede peptider ved hjælp af høj kollisionsenergiafkobling (HCD). Fuldfør en databasesøgning for at identificere fosforyleringssteder.
- Indlæs de rå filer i MaxQuant-softwaren, navngiv eksperimenterne, og indstil brøker og PTM.
BEMÆRK: Selvstudiet af MaxQuant software kan findes på https://www.maxquant.org/. - Vælg reporter ion MS2 i typen af LC-MS/MS-kørsel og 6plex TMT som isobariske etiketter. Aktiver filter efter PIF-funktion, og angiv min.
- Vælg Acetyl (Protein N-term), Oxidation (M) og Phospho (STY) til panelet af variable modifikationer. Vælg Carbamidomethyl (C) som faste ændringer.
- Indstil fordøjelsestilstand som specifik, vælg Trypsin/P som fordøjelsesenzym, og to savnede kavalergang.
- Sæt PSM falsk opdagelse sats (FDR) og protein FDR som 0,01. Angiv minimumscoren for modificerede peptider til 40.
- Føj Arabidopsis thaliana-databasen til panelet af fasta-filer, og kør databasesøgning.
- Indlæs txt-filen på Phospho (STY)-websteder i Perseus-softwaren, når søgningen udføres.
BEMÆRK: De detaljerede tutorials af Perseus software kan findes på https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtrer de omvendte fosforyleringssteder fra. Filtrer de ikke-lokaliserede fosforyleringssteder fra ved hjælp af lokaliseringssandsynlighed 75% som skæring.
- Brug intensiteten af fosforyleringssteder til statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere udførelsen af denne arbejdsgang udnyttede vi IMAC-scenespids kombineret med Hp-RP-fasespidsfraktionering til at måle fosforproteomiske ændringer i vilde og snrk2-dec mutantplanter med eller uden mannitolbehandling i 30 minutter. Hver prøve blev udført i biologiske kalllicater, og den eksperimentelle arbejdsgang er repræsenteret i figur 1. De fordøjede peptider (400 μg) af hver prøve var mærket med en TMT-6plex-kanal, samlet og desaltet. Fosfoptider blev yderligere beriget ved hjælp af en IMAC-trinspids, og de rensede fosfortider blev efterfølgende fraktioneret til otte fraktioner af en Hp-RP-trinspids. Hver fraktion blev analyseret af en 90 min LC gradient analyse. De rå filer blev søgt ved hjælp af en søgemaskine mod Arabidopsis thaliana database.
Der blev identificeret i alt 11.077 unikke fosforptider svarende til 3.630 fosfoproteiner med 6.852 lokaliserede fosforyleringssteder (klasse I, lokaliseringssandsynlighed > 0,75), hvilket indikerer den brede dækning af Arabidopsis phosphoproteome. I alt 8.107 og 7.248 fosfortider blev identificeret fra henholdsvis mutantprøve af vildtype og snrk2-dec. Dette illustrerer arbejdsgangens effektivitet med hensyn til at give dybdegående dækning for afgrænsning af det globale syn på signaltransduktion i Arabidopsis. Vi sammenlignede antallet af identificerede fosfortider på tværs af 8 fraktioner. Et par fosfoptider blev identificeret i de første to fraktioner, fraktionen 1 og 2. De fleste fosfoptider blev imidlertid jævnt fordelt i resten 6 fraktioner (figur 2A), hvilket tyder på, at denne tilgang giver mulighed for at adskille komplekse fosfortider fra plantefosforproteomet. For yderligere at demonstrere adskillelseseffektiviteten af denne arbejdsgang vurderede vi overlapningen af fosforptider mellem to tilstødende fraktioner (eq. F1-til-F2). Mindre end 5 % fosforptider overlapper hinanden i de tilstødende fraktioner, hvilket indikerer en robust fraktioneringseffektivitet af hp-RP-trinspidsen (Figur 2B).
Ved hjælp af de data, der blev opnået af arbejdsgangen, sammenlignede vi fosforproteomiske profiler af vildtype og snrk2-dec mutant ved mannitolbehandling. I alt 433 og 380 fosforyleringssteder blev forøget efter mannitolbehandling i henholdsvis mutantprøve af vildtype og snrk2-dec (figur 3). Blandt, at 312 fosforitter viste induktion (FDR < 0,01) i vilde-type, men ikke i snrk2-dec mutant planter. Analysen af Gene Ontology (GO) viste, at funktionen af fosforylering og aktivering af proteinkinase, regulering af fosfatmetabolisk proces, signaltransduktion, er signifikant beriget i de SnRK2-afhængige fosfoproteiner. Interessant nok blev GO-term relateret til rodudvikling også beriget i SnRK2-afhængig gruppe, i overensstemmelse med fænotypen rodvæksthæmning under osmotisk stress6. Vi har også identificeret 116 fosforer up-reguleret af mannitol behandling i både vilde-type og snrk2-dec mutant. Disse fosfoproteiner var uafhængige af SnRK2, eller kandidater, der mægle osmotisk stress-udløst signalering forud for SnRK2s aktivering. Vi bemærkede, at flere B4-undergruppe-RAF'er som RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) og RAF42 (AT3G46920) var betydeligt reguleret af osmotisk stress. Yderligere undersøgelse viste, at RAF kinases hurtigt aktiveres af osmotisk stress og kræves til fosforylering og aktivering af SnRK2s20.
Figur 1: Arbejdsgang for fasespidsbaseret fosforproteomic-metode. Protein blev udvundet og fordøjet fra vilde typer og snrk2-dec mutantplanter behandlet med eller uden mannitol. De fordøjede peptider for hver replikat var mærket med en unik TMT6-plex-kanal. Fosforptider blev samlet og derefter beriget ved hjælp af en IMAC-scenespids. De rensede fosfoptider blev adskilt af en Hp-RP-trinspids. Hver fraktion blev analyseret af massespektrometer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fosforprotemic profilering af vilde typer og snrk2 decuple mutantplanter af IMAC-scenespids og Hp-RP-fraktionering. (A)Antallet af identificerede fosfoptider pr. fraktion. (B) Adskillelseseffektiviteten af den fasespidsbaserede Hp-RP-kromatografi. Overlapningen mellem de tilstødende fraktioner repræsenteres af procentdelen af den samme peptid, der er identificeret i de tilstødende fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af fosforproteomic ændringer som reaktion på osmotisk stress. Vulkanarealer viser log2-foldændringen af fosforyleringssteder i (A) vilde type og (B) snrk2-dec mutantplanter som reaktion på mannitolbehandling. Den sorte cirkel repræsenterer kinase phosphorylation steder induceret af mannitol. Den røde cirkel angiver fosforyleringsstederne for RAF'er, der er up-reguleret som reaktion på mannitol. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer A | 200 mM ammoniumformat (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Buffer B | 100% ACN. | |
| Buffer 1 | 5% Buffer B, 95% Buffer A. | |
| Buffer 2 | 8% Buffer B, 92% Buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% Buffer B, 89% Buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% Buffer B, 86% Buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% Buffer B, 83% Buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% buffer B, 80% buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% Buffer B, 77% Buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% buffer B, 20% buffer A. | |
Tabel 1: Buffere til hp-RP-fasespidsfraktionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det dynamiske område og kompleksiteten af planteproteom og fosforproteom er stadig en begrænsende faktor til dybden af fosforproteomics analyser. På trods af at LC-MS/MS-analysen med en enkelt kørsel er i stand til at identificere 10.000 fosforyleringssteder21,22, er dækningen af hele plantefosforproteomet stadig begrænset. Derfor kræves der en fosforæmisk arbejdsgang, der giver høj følsomhed og overlegen adskillelseseffektivitet, ved profilering af det globale syn på plantesignalnetværk som reaktion på miljøbelastning. Kommerciel højtryksvæskekromatografi (HPLC) kolonnebaseret kromatografi er en almindelig metode til at reducere peptidkompleksiteten før MS-analyse23,24. Kedelige prøveindsamlingstrin og stor elueringsvolumen er imidlertid de største udfordringer ved HPLC-baserede metoder med hensyn til følsomhed og gennemløb. stage tip er en alternativ tilgang til udførelse af peptidforfraktion eller berigelse til værker med høj følsomhed og høj gennemløb. Denne nye fosforæmiske arbejdsgang, der udnytter isobarisk mærkning kombineret med fosforptidberigelse og fraktionering , giver bedre dækning og dybde af plantephoproteomics over andre fosforproteomic arbejdsgange25,26.
Prøvernes pH-værdi er den afgørende faktor, der bestemmer fosforprædodiders tilsætningsspecifikke specificitet. pH-værdien kan påvirkes af det foregående trin i prøveforberedelsen, så det er vigtigt at kontrollere pH-værdien før prøvebelastning. Hvis pH-værdi flyttes, tilsættes eddikesyre eller natriumhydroxid til prøverne for at justere pH-værdi til 3,0. Vi udfører denne protokol til samtidig udløsning og lastning af fosforptider på C18-trins spids. Det er derfor vigtigt at afbalancere IMAC-trinspidsen inden fosforudsning for at sikre, at koncentrationen af ACN er under 5%.
Antallet af brøker afhænger af kompleksiteten og stikprøvestørrelserne. Typisk er 5 til 8 fraktioner nok til at give bred dækning af fosforidentifikation i planter. Koncentrationen af ACN i fraktioneringsbuffere kan justeres i overensstemmelse med prøvernes hydrofobitet. De fleste fosfortider er beregnet fra C18 perler, der anvender intervallet 5% til 25% ACN-koncentration. Fosfoptider er typisk mere hydrofile sammenlignet med ikke-fosforerede peptider på grund af de yderligere negative afgifter i fosfatgruppen. Mærkning af TMT-reagens på N-terminus af peptid fører imidlertid til en stigning i hydrofobiteten af mærkede peptider27, hvilket kan forklare, hvorfor færre fosforptider blev identificeret i de to første fraktioner i vores tilfælde (Figur 2A). Således kan en test ved hjælp af et TMT-nul reagens og en aliquot af prøver bruges til at evaluere antallet af fraktioner og ACN-koncentrationen i hver fraktioneringsbuffere. De optimerede buffere kan resultere i bedre adskillelseseffektivitet af TMT-6plex-mærkede fosforptider.
Begrænsningerne i fase tip-baseret fraktionering er antallet af fraktioner og kapaciteten af tips. Det er vanskeligt at udvide antallet af brøker i fasespidsseparation, fordi diskontinuerlige gradueringsbuffere bruges til fasespidsfraktionering. På den anden side kan der anvendes en kontinuerlig graduering på HPLC-kolonner for at opnå et højt brøktal. Kapaciteten af tips er en anden faktor, der begrænser anvendelsen af scenetips. Til storstilet fosforproteomicsanalyse (> 10 mg proteiner) er det bedre at anvende HPLC-baseret berigelse med længere kolonnelængde pakket med flere C18 perler og fraktionering, hvilket er ud over den analytiske skala af trinspidser. Samlet set er fasespidsbaseret fosforptidberigelse og fraktionering en nyttig metode til små til mellemstore fosforproteomicsanalyser. Denne tilgang kan integreres med isobarisk mærkning for at opnå multiplekseret kvantificering. Resultaterne viste også, at det kunne anvendes til dybdegående plantephoproteomics profilering og kvantificering. Denne arbejdsgang gælder for andre arter og forskellige vævstyper til afgrænsning af specialiserede signalnetværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det strategiske prioriterede forskningsprogram for det kinesiske videnskabsakademi, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
