Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af MicroRNA-ekspression i nyrerne hos immunoglobulin A nefropatiske mus

Published: July 8, 2020 doi: 10.3791/61535
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

microRNA'er er involveret i patogenesen af IgA nefropati. Vi har udviklet en pålidelig metode til påvisning af microRNA-ekspressionsniveauer i nyrerne hos en IgA-nefropati-musemodel (HIGA-mus). Denne nye metode vil gøre det lettere at kontrollere for miRNAs involvering i IgA nefropati.

Abstract

Immunoglobulin A (IgA) nefropati er en type primær glomerulonefritis karakteriseret ved den unormale aflejring af IgA, hvilket fører til nyresvigt i slutstadiet. I de senere år er involveringen af mikroRNA'er (miRNA'er) blevet rapporteret i patogenesen af IgA-nefropati. Der er imidlertid ingen etableret metode til profilering af miRNA'er i IgA-nefropati ved hjælp af små dyremodeller. Derfor udviklede vi en pålidelig metode til analyse af miRNA i nyren af en IgA-musemodel (HIGA-mus). Målet med denne protokol er at detektere de ændrede ekspressionsniveauer af miRNA'er i nyrerne hos HIGA-mus sammenlignet med niveauerne i nyrerne hos kontrolmus. Kort fortalt består denne metode af fire trin: 1) opnåelse af nyreprøver fra HIGA-mus; 2) oprensning af total RNA fra nyreprøver; 3) syntetisering af komplementært DNA fra total RNA; og 4) kvantitativ revers transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR) af miRNA'er. Ved hjælp af denne metode detekterede vi med succes ekspressionsniveauerne for flere miRNA'er (miR-155-5p, miR-146a-5p og miR-21-5p) i nyrerne hos HIGA-mus. Denne nye metode kan anvendes til andre undersøgelser, der profilerer miRNA'er i IgA-nefropati.

Introduction

Immunoglobulin A (IgA) nefropati er en type primær glomerulonefritis karakteriseret ved den unormale aflejring af IgA i den renale glomerulære mesangialregion 1,2. Det er den mest almindelige af den primære glomerulonefritis og fører til nyresvigt i slutstadiet hos 20%-40% af patienterne2. Årsagen er stadig ukendt, men vedvarende slimhindeinfektion er impliceret 1,3. Kortikosteroider, immunsuppressiva og renin-angiotensinsystemhæmmere er blevet foreslået som terapeutiske metoder1,3, men er ikke blevet fuldstændigt etableret3. Derfor er der behov for yderligere forskning for at afklare ætiologien og terapeutiske metoder til behandling af IgA nefropati.

microRNA'er (miRNA'er) er små, ikke-kodende RNA'er, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af genekspression 4,5. miRNA'er rapporteres at være involveret i patogenesen af forskellige sygdomme, og nogle er blevet identificeret som sygdomsbiomarkører og terapeutiske midler 4,5. I de senere år er der også rapporteret en sammenhæng mellem miRNA'er og patogenesen af IgA-nefropati 2,6,7. For eksempel viste miR-148b sig at være involveret i strukturelle abnormiteter af IgA hos patienter med IgA nefropati 2,6,7, mens miR-148b og let-7b blev dokumenteret som nye biomarkører til påvisning af IgA nefropati7. Selvom forståelse af virkningerne af miRNA'er på IgA-nefropati kan hjælpe yderligere med at belyse ætiologi og behandling 2, er standardmetoder til profilering af miRNA'er i IgA-nefropati ved hjælp af små dyremodeller endnu ikke etableret2.

Vi har heri udviklet en enkel og pålidelig metode til måling af miRNA ekspressionsniveauer i nyrerne hos en IgA nefropati musemodel (HIGA mus). HIGA musen er en karakteristisk ddY-stamme, der viser et særligt højt niveau af serum IgA og den unormale aflejring af IgA i nyreglomeruli 8,9,10,11. Derfor kan HIGA-mus bruges som en IgA nefropati musemodel 8,9,10,11. Vores metode består af fire hovedtrin: For det første kirurgisk opnåelse af nyreprøver fra HIGA-mus; for det andet homogenisering af prøver og rensning af total RNA ved anvendelse af en silicamembranbaseret spinsøjle; for det tredje syntetisering af komplementært DNA (cDNA) fra total RNA ved anvendelse af revers transkription; og for det fjerde detektering af ekspressionsniveauerne af miRNA ved kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR). Begrundelsen for denne metode og resultaternes pålidelighed er baseret på tidligere rapporter12,13. Vi viser, at dette er en nyttig teknik til nøjagtigt at måle miRNA-ekspressionsniveauer i en IgA-nefropati-musemodel, og at den kan bruges til at lette fremtidig forskning i miRNA'er i IgA-nefropati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og overholder retningslinjerne for brug og pleje af forsøgsdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. Indhentning af nyreprøver fra HIGA-mus

BEMÆRK: HIGA mus viser en stabil fænotype af IgA nefropati efter 25 ugers alderen 8,9,10,11. Balb/c-mus bør vælges som kontrolgruppe 8,9,10,11. Der blev opnået 25 uger gamle kvindelige HIGA-mus (n = 10) og 25 uger gamle Balb/c-hunmus (n = 10). Det er nødvendigt at bestemme antallet af mus, der kræves til eksperimenter på forhånd. Dette trin kræver ca. 7-8 timer for en prøvestørrelse på 10 HIGA-mus og 10 Balb/c-mus.

  1. Forbered disse emner: HIGA-mus (25 uger gamle, hun), Balb / c-mus (25 uger gamle, kvinde), inhalationsanæstesiapparat, isofluran, korkark, stift, fosfatbufret saltvand (PBS), injektionssprøjter, nåle, kirurgisk saks og tang.
  2. Bedøv en HIGA-mus med 4-5% isofluran med inhalationsanæstesiapparat og monter den i dorsal position på korkpladen ved hjælp af stifter. Juster koncentrationen af isofluran til 2%-3% som vedligeholdelsesdosis efter induktion af anæstesi.
    BEMÆRK: Dybden af anæstesi opretholdes på et niveau, hvor smerten forbundet med den invasive procedure elimineres fuldstændigt. Især bør isoflurankoncentrationen justeres til 4-5 % ved udskæring af væv såsom thorax. Hårfjerning og øjensalve er ikke afgørende. Det er ikke nødvendigt at montere musen på en varmepude, hvis proceduren kan udføres hurtigt.
  3. Lav et 3-4 cm midterliniesnit af musens abdominalvæg med kirurgisk saks og tang og identificer omhyggeligt begge sider af nyrerne.
  4. Skær ribbenene og membranen med kirurgisk saks og tang for at udsætte hjertet. Efter indskæring af højre atrium injiceres PBS i venstre ventrikel, indtil nyrefarven ændres til lysegul (denne procedure betyder, at hele musens krop er perfuseret med PBS.)
  5. Skær nyrearterien, nyrevenen og urinlederen, og fjern nyrerne. Opdel nyren i 30 mg stykker til brug i næste trin.
    BEMÆRK: Patologien af IgA nefropati involverer hovedsageligt glomerulus i nyrebarken (ydre del af nyrerne). Selv om det er vanskeligt at makroskopisk og fuldstændigt skelne cortex og medulla, er det ønskeligt at samle den ydre del af nyrerne hovedsageligt. Disse prøver kan opbevares ved –80 °C i flere måneder.

2. Oprensning af total RNA fra nyreprøver

BEMÆRK: I dette trin anvendes kommercielt tilgængeligt miRNA-isolationssæt til ekstraktion af total RNA. Derudover anvendes biopolymer-makulering spinsøjle. Se Materialefortegnelse for yderligere oplysninger. miRNA-isolationssæt indeholder en silicamembranbaseret spinsøjle, phenol/guanidinbaserede lysereagenser, guanidin/ethanolvaskebuffer (vaskebuffer 1), ethanolvaskebuffer (vaskebuffer 2) og nukleasefrit vand. Dette trin kræver ca. 3 timer for en prøvestørrelse på 10 HIGA-mus og 10 kontrolmus.

  1. Forbered følgende emner: 1,5 eller 2,0 ml opsamlingsrør, 100% ethanol, chloroform, siliciumhomogenisator, mikropipetter, pipettespidser, centrifuge, spinsøjle med biopolymermakulering, silicamembranbaseret spinsøjle, phenol/guanidinbaserede lysereagenser, guanidin/ethanolvaskebuffer (vaskebuffer 1), ethanolvaskebuffer (vaskebuffer 2) og nukleasefrit vand.
  2. 30 mg nyreprøver homogeniseres ved hjælp af en siliciumhomogenisator og 700 μL phenol/guanidinbaseret lyseagens ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: miRNA'erne i prøven er sårbare, indtil de har været udsat for phenol / guanidinbaseret lysereagens, så disse trin skal udføres straks.
  3. Overfør lysatet til spinsøjlen for biopolymermakulering og centrifuger det ved 15.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.
  4. Der tilsættes 140 μL chloroform til filtratet og blandes kraftigt i 15 s. Lad stå i 2-3 minutter, centrifuger derefter ved 12.000 x g ved 4 °C i 15 minutter.
  5. Den klare supernatant overføres forsigtigt uden at røre det midterste lag til et nyt opsamlingsrør, og det bestemte rumfang (se nedenfor) af 100% ethanol tilsættes. Vortex i 5 s.
    BEMÆRK: Der kræves 100% ethanol ved 1,5x volumenet af den opnåede supernatant.
  6. Prøven overføres (øvre grænse 700 μL) til en silicamembranbaseret spinsøjle, og prøven centrifugeres ved stuetemperatur i 15 s ved 8.000 x g. Filtratet kasseres efter centrifugering.
  7. Der tilsættes 700 μL vaskebuffer 1 til den silicamembranbaserede centrifugeringssøjle, og kolonnen centrifugeres ved stuetemperatur i 15 s ved 8.000 x g. Filtratet kasseres efter centrifugering.
  8. Der tilsættes 500 μL vaskebuffer 2 til den silicamembranbaserede centrifugeringssøjle, og centrifugeres ved stuetemperatur i 15 s ved 8.000 x g. Filtratet kasseres efter centrifugering.
  9. Der tilsættes 500 μL vaskebuffer 2 til den silicamembranbaserede centrifugeringssøjle, og centrifugeres ved stuetemperatur i 15 s ved 8.000 x g. Filtratet kasseres efter centrifugering.
  10. Den silicamembranbaserede centrifugeringssøjle centrifugeres igen uden tilsætning af noget for at fjerne yderligere ethanol ved 15.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Smid filtratet væk efter centrifugering.
  11. Skift røret, der er fastgjort til centrifugeringssøjlen, til et nyt opsamlingsrør.
  12. Tilsæt 30 μL nukleasefrit vand til den silicamembranbaserede spinsøjle og centrifuger den ved 8.000 x g i 1 min ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Den resulterende 30 μL opløsning indeholder en høj koncentration af total RNA. Denne prøve kan opbevares ved –80 °C i flere måneder.

3. Syntese af cDNA fra total RNA

BEMÆRK: I dette trin bruges et kommercielt tilgængeligt omvendt transskriptionssæt. Se Materialefortegnelse for yderligere oplysninger. Dette sæt indeholder nukleinsyreblanding, revers transkriptaseblanding og buffer. Denne procedure skal udføres på is for at forhindre fremskridt i reaktionen. Dette trin kræver ca. 3 timer for en prøvestørrelse på 10 HIGA-mus og 10 kontrolmus.

  1. Forbered følgende emner: 1,5 ml opsamlingsrør, otte brøndstrimmelrør, mikropipetter, pipettespidser, spektrofotometer, nukleasefrit vand, is, nukleinsyreblanding, revers transkriptaseblanding, buffer og termisk cyklist.
  2. Mål koncentrationen af total RNA ved hjælp af et spektrofotometer. Beregn derefter det krævede volumen nukleasefrit vand, så 12 μL indeholder 1 μg total RNA.
  3. Der fremstilles en masterblanding med følgende indhold: 2,0 μL nukleinsyreblanding, 2,0 μL revers transkriptaseblanding og 4,0 μL buffer til i alt 8,0 μL pr. prøve.
  4. Der tilsættes 8 μL af masterblandingen til hvert hul med bånd med otte brønde.
  5. Fortynd total RNA i volumenet af nukleasefrit vand beregnet i 3.2. Derefter tilsættes 12 μL af den totale RNA-opløsning (indeholdende 1 μg total RNA) til hver brønd med otte brøndstrimmelrør.
  6. Prøven inkuberes i 8 brøndbåndsrør ved 37 °C i 60 minutter ved hjælp af termisk cyklist. Derefter inkuberes ved 95 °C i 5 minutter ved hjælp af termisk cyklist.
    BEMÆRK: Opløsningen efter inkubation indeholder en høj koncentration af cDNA.
  7. Overfør denne opløsning til et 1,5 ml rør og tilsæt 200 μL nukleasefrit vand.
    BEMÆRK: De resulterende 200 μL opløsning kan bruges til qRT-PCR som en skabelon cDNA. Denne prøve kan opbevares ved –80 °C i ca. 1 år.

4. qRT-PCR af miRNA

BEMÆRK: I dette trin bruges et kommercielt tilgængeligt PCR-sæt. Se Materialefortegnelse for yderligere oplysninger. Dette sæt indeholder PCR-blanding, universal primer og nukleasefrit vand. Prøverne skal fremstilles i to eksemplarer, og nøjagtigheden af resultaterne bør overvejes i hvert enkelt tilfælde. Ekspressionsniveauer af miRNA kvantificeres ved ΔΔCT-metoden. Dette trin kræver ca. 4 timer for en prøvestørrelse på 10 HIGA-mus og 10 kontrolmus.

  1. Forbered følgende emner: 1,5 ml opsamlingsrør, 96-brønds reaktionsplade, klæbende film til 96-brønds reaktionspladen, mikropipetter, pipettespidser, PCR-blanding, universel primer, nukleasefrit vand, miRNA-specifikke primere og et PCR-instrument i realtid.
  2. Forbered masterblandingen med følgende indhold: 12,5 μL PCR-blanding, 2,5 μL universalprimer, 1,25 μL 5 μM miRNA-specifik primer og 6,25 μL nukleasefrit vand til hvert hul.
    BEMÆRK: I dette assay blev primere, der er specifikke for miRNA'er [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p og miR-21-5p] anvendt. RNU6-2 blev anvendt som en endogen kontrol14.
  3. Der tilsættes 22,5 μL af masterblandingen til hvert hul i 96 brøndreaktionspladen.
  4. Der tilsættes 2,5 μL cDNA fremstillet i trin 3.7 til det enkelte hul i 96-brøndpladen.
  5. 96 brøndreaktionspladen dækkes med vedhæftningsfilm, og centrifugeres derefter ved 1.000 x g i 30 s.
  6. Kør PCR-instrumentet i realtid. PCR-instrumentet programmeres på følgende måde: første aktivering ved 95 °C i 15 minutter, derefter 40 denatureringscyklusser ved 94 °C i 15 sekunder, udglødning ved 55 °C i 30 sek. og forlængelse ved 70 °C i 30 s.
  7. Kvantificer genekspression ved hjælp af ΔΔCT-metoden. Relative ekspressionsniveauer bestemmes som 2–ΔΔCT.
    BEMÆRK: Unormale PCR-amplifikationskurver bør overvejes for udelukkelse fra resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi undersøgte ekspressionsniveauerne af miRNA'er i nyrerne hos HIGA-mus (n = 10). Dette resultat blev opnået fuldstændigt baseret på den beskrevne protokol. Balb/c-musenes nyrer blev valgt som kontrol (n=10). I begge grupper blev der udvalgt 25 uger gamle. Kun kvindelige HIGA-mus var tilgængelige fra leverandøren. Ekspressionsniveauerne for tre miRNA'er (miR-155-5p, miR-146a-5p og miR-21-5p; Figur 1) blev påvist, som tidligere blev rapporteret at være forbundet med IgA nefropati15,16. Relative miRNA-ekspressionsniveauer for de to grupper blev sammenlignet ved hjælp af en t-test, hvor P < 0,05 var statistisk signifikant. miR-155-5p blev udtrykt ved 3,3 gange højere niveauer i HIGA-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (P < 0,001), mens miR-21-5p blev udtrykt ved 1,58 gange højere niveauer i HIGA-gruppen (P = 0,007). miR-146a-5p-ekspression adskilte sig ikke signifikant mellem de to grupper.

Figure 1
Figur 1: Ekspressionsniveauer af miRNA'er i nyrerne hos HIGA-mus. qRT-PCR bestemte de relative ekspressionsniveauer for miR-155-5p, miR-146a-5p og miR-21-5p i HIGA-mus (n = 10) og Balb/c-mus (n = 10). Relative udtryksniveauer vises som middelværdier og standardfejl. (A) miR-155-5p-ekspression var 3,3 gange højere i HIGA-gruppen (P < 0,001). (B) miR-146a-5p-ekspression adskilte sig ikke signifikant mellem de to grupper. (C) miR-21-5p-ekspression var 1,58 gange højere i HIGA-gruppen (P = 0,007). kvantitativ realtids omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR); mikroRNA'er (miRNA'er); ikke signifikant (NS); *, s. <0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi var i stand til at måle ekspressionsniveauerne af miRNA'er i nyrerne hos en IgA nefropati musemodel (HIGA mus) ved hjælp af denne nye metode. IgA nefropati er en uforklarlig sygdom, der kræver yderligere forskning for at afklare dens ætiologi og terapeutiske mål 1,3. Imidlertid er opnåelse af humane nyreprøver meget invasiv. Denne nye teknik er fordelagtig, fordi den tillader undersøgelse af IgA-nefropati ved hjælp af små dyr og bør lette fremtidig forskning i IgA-nefropati og miRNA'er. I en fremtidig undersøgelse kunne denne metode anvendes til undersøgelse af nye miRNA'er til behandling af IgA-nefropati. Kunstig modulering af miRNA'er i HIGA-mus kan påvirke fænotypen af IgA-nefropati. I så fald kan denne metode være nyttig til verifikation af ændringer af miRNA'er. Denne metode er ikke beregnet til analyse af miRNA'er i serum, men det kan være muligt at bruge den til dette ved at ændre protokollen.

Begrundelsen for denne metode er baseret på tidligere rapporter. Vi brugte spinkolonner til biopolymer-makulering til at forstyrre biopolymerer i prøven, hvilket tidligere har vist sig at være en effektiv teknik12. Tidligere rapporter har også vist nøjagtigheden af at syntetisere cDNA fra total RNA ved hjælp af revers transkription og udføre PCR ved hjælp af det forberedte cDNA som skabelon13. Som et kritisk trin i denne metode er evaluering af PCR-resultaterne vigtig. Det er nødvendigt at udelukke unormale forstærkningskurver fra resultaterne. Desuden bør ændringer i endogene kontroller overvejes, hvis der ikke opnås stabile resultater14.

Et stort problem, der kan opstå med denne metode, er den unormalt lave ekspression af miRNA'er. miRNA'er er meget nedbrydelige forbindelser, så metoden skal udføres hurtigt. Derudover skal virkningerne af ribonuklease (RNase) i forsøgsmiljøet elimineres. Forskere bør altid være opmærksomme på tilstedeværelsen af RNase i hud og hår17. Det er nødvendigt at bære engangshandsker, masker og hårhætter til forsøg. Derudover skal laboratorieudstyr såsom mikropipetter, pipettespidser og opsamlingsrør rengøres for at sikre, at RNase17 ikke forekommer. Deaktivering af RNase ved hjælp af en autoklave skal udføres efter behov17. Ellers bør forskere bruge RNase-fri-certificerede emner17. Alle prøver skal opbevares korrekt under de anbefalede betingelser for at reducere risikoen for RNase-kontaminering.

Vores metode har tre vigtige begrænsninger. Den første er, at vi ikke påviste, om det kan anvendes på andre dyr og andre organer. Dette er relevant, fordi miRNA'er er kendt for at spille en vigtig rolle i blodlegemer i IgA nefropati 2,6,7, men vi undersøgte ikke, om vores metode kan bruges i blodlegemer. For det andet kan stikprøvestørrelsen af vores eksperimenter være lille. Prøvestørrelsen skal bestemmes afhængigt af undersøgelsesdesignet, statistisk analyse, krævet tid og krævede omkostninger. Derfor skal hver forsker bestemme den passende prøvestørrelse, inden denne test påbegyndes. For det tredje kan sværhedsgraden og fænotypen af IgA-nefropati hos HIGA-mus variere mellem individer9. Derudover er skævheden mellem køn og alder ikke blevet undersøgt fuldt ud. Det anbefales at tilføje immunhistokemi for at bekræfte sværhedsgraden og fænotypen af IgA nefropati, hvis det er nødvendigt. Derudover anbefales andre metoder end PCR, herunder microarray, northern blotting og ribonukleasebeskyttelsesassays, at udføre efter behov.

Afslutningsvis udviklede vi en pålidelig metode til måling af ekspressionsniveauerne af miRNA'er i nyrerne i en IgA-musemodel (HIGA-mus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Sarah Williams, ph.d., fra Edanz Group (www.edanzediting.com) for at redigere et udkast til dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit Qiagen 218161 Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2) Qiagen MS00033740 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p) Qiagen MS00001701 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p) Qiagen MS00001638 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p) Qiagen MS00009079 miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder Qiagen 79654 biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument software
takara biomasher standard Takara Bio 9790B silicon homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 161 microRNA IgA nefropati HIGA mus qRT-PCR nyre ekspression
Påvisning af MicroRNA-ekspression i nyrerne hos immunoglobulin A nefropatiske mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H.,… More

Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H., Aomatsu, A., Ito, K., Hirai, K., Ookawara, S., Ishibashi, K., Morishita, Y. Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice. J. Vis. Exp. (161), e61535, doi:10.3791/61535 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter