Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères
Summary
Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.
Abstract
Le phénotype cellulaire peut être inversé ou modifié avec différentes méthodes, avec des avantages et des limites spécifiques à chaque technique. Nous décrivons ici une nouvelle stratégie qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Deux étapes principales sont nécessaires. Dans un premier temps, les cellules matures adultes (différenciées en phase terminale) sont exposées à la gomme épigénétique 5-aza-cytidine pour les conduire dans un état pluripotent. Cette partie du protocole a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes épigénétiques contrôlant le devenir et la différenciation cellulaires, et implique l’utilisation du modificateur épigénétique pour effacer l’état différencié cellulaire, puis conduire dans une fenêtre transitoire de haute plasticité.
Dans la deuxième étape, les cellules effacées sont encapsulées dans des micro-bioréacteurs en polytétrafluoroéthylène (PTFE), également connus sous le nom de marbres liquides, pour favoriser le réarrangement cellulaire 3D afin d’étendre et de maintenir de manière stable la haute plasticité acquise. Le PTFE est un composé synthétique hydrophobe non réactif et son utilisation permet la création d’un microenvironnement cellulaire, ce qui ne peut être réalisé dans les systèmes de culture 2D traditionnels. Ce système encourage et stimule le maintien de la pluripotence grâce à des indices liés à la biomécanosension.
Les procédures techniques décrites ici sont des stratégies simples pour permettre l’induction et le maintien d’un état de plasticité élevé dans les cellules somatiques adultes. Le protocole a permis la dérivation de cellules à haute plasticité chez toutes les espèces de mammifères testées. Comme il n’implique pas l’utilisation de la transfection de gènes et qu’il est exempt de vecteurs viraux, il peut représenter une avancée technologique notable pour les applications de médecine translationnelle. En outre, le système de micro-bioréacteur fournit une avancée notable dans la technologie organoïde des cellules souches en recréant in vitro un micro-environnement spécifique qui permet la culture à long terme de cellules à haute plasticité, à savoir en tant que CSE, csi, cellules épigénétiquement effacées et CSM.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le concept largement accepté de progression unidirectionnelle vers l’engagement et la différenciation cellulaires a été complètement révisé. Il a été démontré que la spécification cellulaire peut être inversée et qu’une cellule différenciée en phase terminale peut être poussée vers un état permissif moins engagé et plus élevé, en utilisant différentes méthodes.
Parmi les nombreuses méthodes proposées, l’une des plus prometteuses consiste à utiliser des composés chimiques pour induire les cellules dans une pluripotence dite induite chimiquement. Les petites molécules utilisées dans cette approche sont capables d’interagir et de modifier la signature épigénétique d’une cellule mature adulte, évitant ainsi le besoin de tout vecteur transgénique et/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études ont récemment montré qu’il est possible de passer de cellules d’un phénotype à un autre en fournissant des stimuli biochimiques et biologiques spécifiques qui induisent la réactivation des gènes hyperméthylés 11,12,13,14,15. Ces événements de déméthylation permettent la conversion de cellules différenciées en phase terminale en un progéniteur primitif, une cellule multipotente ou une cellule à haute plasticité/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallèlement, de nombreuses études se sont récemment concentrées sur la compréhension des indices liés à la mécanosension et, plus spécifiquement, sur la possibilité d’utiliser des forces mécaniques pour influencer directement la plasticité cellulaire et/ou la différenciation 16,17,18,19. En effet, il a été clairement démontré que la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle clé dans le contrôle du devenir cellulaire. En particulier, les signaux biomécaniques et biophysiques produits par l’ECM régulent directement les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation, influençant le comportement et les fonctions cellulaires20,21. Ces données récentes ont ouvert la voie au développement de nouveaux systèmes de culture 3D qui imitent plus étroitement le microenvironnement cellulaire in vivo, reproduisant des stimuli mécaniques et physiques qui déterminent le comportement cellulaire.
Nous décrivons ici un protocole en deux étapes qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Dans la première étape, les cellules sont incubées avec la molécule déméthylante 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Cet agent est capable d’induire une déméthylation globale significative de l’ADN grâce à un effet combiné de l’action 8,10 médiée par la translocation directedix-onze (TET2) et de l’inhibition indirecte des ADN méthyltransférases (DNMT)22,23. Cette étape induit l’élimination des blocs épigénétiques avec une réactivation ultérieure de l’expression génique liée à la pluripotence et, par conséquent, la génération de cellules à haute plasticité 1,2,3,8,10, ci-après dénommées « cellules épigénétiquement effacées ». Dans la deuxième étape, les cellules sont encapsulées dans un système de culture 3D. À cette fin, le composé synthétique hydrophobe non réactif polytétrafluoroéthylène (PTFE; avec une taille de particule de 1 μm) est utilisé comme micro-bioréacteur, ce qui permet la création d’un microenvironnement cellulaire irréalisable grâce à l’utilisation de systèmes de culture 2D traditionnels10. Les particules de poudre de PTFE adhèrent à la surface de la goutte de liquide dans laquelle les cellules sont remises en suspension et isolent le noyau liquide de la surface de support, tout en permettant l’échange de gaz entre le liquide intérieur et l’environnement environnant24. Le « micro-bioréacteur PTFE » ainsi obtenu, également connu sous le nom de « marbre liquide », encourage les cellules à interagir librement les unes avec les autres, favorisant le réarrangement cellulaire 3D 25,26,27, et étend et maintient de manière stable l’état de plasticité élevé acquis grâce à des indices liés à la biomécanosension10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des dernières décennies, plusieurs études se sont concentrées sur le développement de stratégies pour ramener une cellule différenciée en phase terminale vers un état permissif moins engagé et plus élevé. Le protocole décrit ici permet la génération et le maintien à long terme de cellules pluripotentes à partir de cellules matures matures différenciées en phase terminale. La méthode combine deux étapes indépendantes qui impliquent l’induction d’un état permissif élevé qui est obtenu …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tous les auteurs sont membres de l’action COST CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referências
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
