אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים
Summary
אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.
Abstract
ניתן להפוך או לשנות את הפנוטיפ של התא בשיטות שונות, עם יתרונות ומגבלות ספציפיים לכל טכניקה. כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. נדרשים שני שלבים עיקריים. בשלב הראשון, תאים בוגרים בוגרים (ממוינים באופן סופני) נחשפים למחק האפיגנטי 5-אזה-ציטידין כדי להניע אותם למצב פלוריפוטנטי. חלק זה של הפרוטוקול פותח, בהתבסס על ההבנה הגוברת של המנגנונים האפיגנטיים השולטים בגורל התאים ובהתמיינותם, וכרוך בשימוש במשנה האפיגנטי כדי למחוק את מצב התאים המובחנים ולאחר מכן לנסוע לתוך חלון פלסטיות גבוה חולף.
בשלב השני, תאים שנמחקו עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של פוליאטטרפלואורואתילן (PTFE), הידועים גם בשם Liquid Marbles, כדי לקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים כדי להרחיב ולשמור ביציבות על הפלסטיות הגבוהה הנרכשת. PTFE היא תרכובת סינתטית הידרופובית לא תגובתית והשימוש בה מאפשר יצירת מיקרו-סביבה תאית, שלא ניתן להשיגה במערכות תרביות דו-ממדיות מסורתיות. מערכת זו מעודדת ומגבירה את התחזוקה של פלוריפוטנטיות באמצעות רמזים הקשורים לביו-מכנוסנסינג.
ההליכים הטכניים המתוארים כאן הם אסטרטגיות פשוטות כדי לאפשר אינדוקציה ותחזוקה של מצב פלסטיות גבוהה בתאים סומטיים בוגרים. הפרוטוקול איפשר את הפקתם של תאי פלסטיות גבוהה בכל מיני היונקים שנבדקו. מכיוון שהיא אינה כרוכה בשימוש בטרנספקציה של גנים והיא נקייה מווקטורים ויראליים, היא עשויה לייצג התקדמות טכנולוגית בולטת עבור יישומי רפואה תרגומית. יתר על כן, מערכת המיקרו-ביו-ריאקטורים מספקת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי גזע על ידי יצירה מחדש במבחנה של מיקרו-סביבה ספציפית המאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאים בעלי פלסטיות גבוהה, כלומר ESCs, iPSCs, תאים שנמחקו אפיגנטית ו-MSCs.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, הרעיון המקובל של התקדמות חד-כיוונית לעבר מחויבות והתמיינות של תאים שונה לחלוטין. הוכח כי ניתן להפוך את אפיון התא, וניתן לדחוף תא ממוין סופני לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר, בשיטות שונות.
בין מספר השיטות המוצעות, אחת השיטות המבטיחות ביותר כוללת שימוש בתרכובות כימיות כדי לגרום לתאים למה שמכונה פלוריפוטנטיות המושרה כימית. המולקולות הקטנות המשמשות בגישה זו מסוגלות לקיים אינטראקציה ולשנות את החתימה האפיגנטית של תא בוגר בוגר, תוך הימנעות מהצורך בכל וקטור מהונדס ו/או ויראלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים הראו לאחרונה כי ניתן להעביר תאים מפנוטיפ אחד למשנהו על ידי מתן גירויים ביוכימיים וביולוגיים ספציפיים המעוררים הפעלה מחדש של גנים היפר-מתילים 11,12,13,14,15. אירועים אלה של דה-מתילציה מאפשרים המרה של תאים ממוינים סופניים לאב פרימיטיבי, רב-פוטנטי או לתא בעל פלסטיות גבוהה/פלוריפוטנטית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
במקביל, מחקרים רבים התמקדו לאחרונה בהבנת רמזים הקשורים למכנוזנסינג, ובאופן ספציפי יותר, באפשרות להשתמש בכוחות מכניים כדי להשפיע ישירות על פלסטיות ו/או התמיינות של תאים 16,17,18,19. ואכן, הוכח בבירור כי המטריצה החוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד מפתח בשליטה על גורל התא. בפרט, האותות הביומכניים והביו-פיזיקליים המיוצרים על ידי ECM מווסתים ישירות את המנגנונים המולקולריים ואת מסלולי האיתות, ומשפיעים על התנהגות התאים ועל תפקודיהם20,21. נתונים עדכניים אלה סללו את הדרך לפיתוח מערכות תרביות תלת-ממדיות חדשניות המחקות באופן הדוק יותר את המיקרו-סביבה של תאי in vivo, ומשכפלות גירויים מכניים ופיזיים המניעים את התנהגות התאים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי המשלב את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. בשלב הראשון, התאים מודגרים עם מולקולת הדה-מתילציה 5-אזה-ציטידין (5-aza-CR). סוכן זה מסוגל לגרום לדה-מתילציה גלובלית משמעותית של הדנ”א באמצעות השפעה משולבת של הפעולה הישירה של עשר-אחת-עשרה טרנסלוקציה 2 (TET2) בתיווך 8,10 והעיכוב העקיף של מתיל-טרנספראזות הדנ”א (DNMT)22,23. שלב זה גורם להסרת הבלוקים האפיגנטיים עם הפעלה מחדש לאחר מכן של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, ולכן, יצירת תאים בעלי פלסטיות גבוהה 1,2,3,8,10, להלן “תאים שנמחקו אפיגנטית”. בשלב השני, התאים עטופים במערכת תרבית תלת-ממדית. לשם כך, התרכובת הסינתטית ההידרופובית הלא תגובתית polytetrafluoroethylene (PTFE; עם גודל חלקיק של 1 מיקרומטר) משמשת כמיקרו-ביוריאקטור, המאפשרת יצירת מיקרו-סביבה תאית שאינה ניתנת להשגה באמצעות שימוש במערכות תרבית דו-ממדיות מסורתיות10. חלקיקי אבקת ה-PTFE נצמדים לפני השטח של טיפת הנוזל שבה התאים נתלים מחדש ומבודדים את ליבת הנוזל מהמשטח התומך, תוך שהם מאפשרים חילופי גזים בין הנוזל הפנימי לסביבה24 שמסביב. “מיקרו-ביוריאקטור PTFE” שהתקבל כך, הידוע גם בשם “שיש נוזלי”, מעודד את התאים לקיים אינטראקציה חופשית זה עם זה, מקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים 25,26,27, ומרחיב ושומר ביציבות על מצב הפלסטיות הגבוהה הנרכשת למרות רמזים הקשורים לביו-מכניזנסינג10.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים התמקדו בפיתוח אסטרטגיות להחזרת תא מובחנות סופנית לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ייצור ותחזוקה ארוכת טווח של תאים פלוריפוטנטיים החל מתאים בוגרים בוגרים שהתמיינו באופן סופני. השיטה משלבת שני שלבים בלתי תלויים הכוללים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן Carraresi ומזהה מרכז המזון MiND: 1176436. כל המחברים הם חברים ב- COST Action CA16119 In vitro 3-D סה”כ הדרכה וכושר תאים (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referências
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
