Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos
Summary
Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.
Abstract
El fenotipo celular puede ser revertido o modificado con diferentes métodos, con ventajas y limitaciones que son específicas para cada técnica. Aquí describimos una nueva estrategia que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. Se requieren dos pasos principales. En el primer paso, las células adultas maduras (diferenciadas terminalmente) se exponen al borrador epigenético 5-aza-citidina para llevarlas a un estado pluripotente. Esta parte del protocolo se desarrolló, basada en la creciente comprensión de los mecanismos epigenéticos que controlan el destino y la diferenciación celular, e implica el uso del modificador epigenético para borrar el estado diferenciado celular y luego conducir a una ventana transitoria de alta plasticidad.
En el segundo paso, las células borradas se encapsulan en microbiorreactores de politetrafluoroetileno (PTFE), también conocidos como mármoles líquidos, para promover el reordenamiento celular 3D para extender y mantener de manera estable la alta plasticidad adquirida. El PTFE es un compuesto sintético hidrófobo no reactivo y su uso permite la creación de un microambiente celular, lo que no se puede lograr en los sistemas tradicionales de cultivo 2D. Este sistema fomenta e impulsa el mantenimiento de la pluripotencia a través de señales relacionadas con la biomenosensing.
Los procedimientos técnicos descritos aquí son estrategias simples para permitir la inducción y el mantenimiento de un estado de alta plasticidad en células somáticas adultas. El protocolo permitió la derivación de células de alta plasticidad en todas las especies de mamíferos probadas. Dado que no implica el uso de la transfección génica y está libre de vectores virales, puede representar un avance tecnológico notable para las aplicaciones de la medicina traslacional. Además, el sistema de microbiorreactor proporciona un avance notable en la tecnología de organoides de células madre mediante la recreación in vitro de un microambiente específico que permite el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad, es decir, como ESC, iPSC, células borradas epigenéticamente y MSC.
Introduction
Durante las últimas décadas, se revisó por completo el concepto ampliamente aceptado de progresión unidireccional hacia el compromiso y la diferenciación celular. Se ha demostrado que la especificación celular puede ser revertida, y una célula diferenciada terminalmente puede ser empujada hacia un estado menos comprometido y más permisivo, utilizando diferentes métodos.
Entre los varios métodos propuestos, uno de los métodos más prometedores implica el uso de compuestos químicos para inducir a las células a una llamada pluripotencia inducida químicamente. Las pequeñas moléculas utilizadas en este abordaje son capaces de interactuar y modificar la firma epigenética de una célula adulta madura, evitando la necesidad de cualquier vector transgénico y/o viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosos estudios han demostrado recientemente que es posible cambiar las células de un fenotipo a otro proporcionando estímulos bioquímicos y biológicos específicos que inducen la reactivación de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Estos eventos desmetilantes permiten la conversión de células diferenciadas terminalmente en un progenitor primitivo, una célula multipotente o de alta plasticidad/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Paralelamente, muchos estudios se han centrado recientemente en la comprensión de las señales relacionadas con la mecanodetección y, más concretamente, en la posibilidad de utilizar fuerzas mecánicas para influir directamente en la plasticidad y/o diferenciación celular 16,17,18,19. De hecho, se ha demostrado claramente que la matriz extracelular (ECM) juega un papel clave en el control del destino celular. En particular, las señales biomecánicas y biofísicas producidas por la ECM regulan directamente los mecanismos moleculares y las vías de señalización, influyendo en el comportamiento y las funciones celulares20,21. Estos datos recientes han allanado el camino para el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo 3D que imitan más de cerca el microambiente celular in vivo, replicando estímulos mecánicos y físicos que impulsan el comportamiento celular.
Aquí describimos un protocolo de dos pasos que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. En el primer paso, las células se incuban con la molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente es capaz de inducir una significativa desmetilación global del ADN a través de un efecto combinado de la acción directa mediada por la translocación 2 (TET2) 8,10 y la inhibición indirecta de las ADN metiltransferasas (DNMT)22,23. Este paso induce la eliminación de los bloqueos epigenéticos con una posterior reactivación de la expresión génica relacionada con la pluripotencia y, por tanto, la generación de células de alta plasticidad 1,2,3,8,10, en adelante denominadas “células borradas epigenéticamente”. En el segundo paso, las células se encapsulan en un sistema de cultivo 3D. Para ello, se utiliza como microbiorreactor el compuesto sintético hidrofóbico no reactivo politetrafluoroetileno (PTFE; con un tamaño de partícula de 1 μm), que permite la creación de un microambiente celular inalcanzable mediante el uso de sistemas tradicionales de cultivo 2D10. Las partículas de polvo de PTFE se adhieren a la superficie de la gota líquida en la que las células se vuelven a suspender y aíslan el núcleo líquido de la superficie de soporte, al tiempo que permiten el intercambio de gases entre el líquido interior y el entorno circundante24. El “microbiorreactor de PTFE” así obtenido, también conocido como “Mármol Líquido”, anima a las células a interactuar libremente entre sí, promoviendo el reordenamiento celular 3D 25,26,27, y extiende y mantiene de forma estable el estado de alta plasticidad adquirido a través de señales relacionadas con la biomenosensibilidad 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante las últimas décadas, varios estudios se centraron en el desarrollo de estrategias para revertir una célula diferenciada terminalmente hacia un estado menos comprometido y más permisivo. El protocolo aquí descrito permite la generación y el mantenimiento a largo plazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras diferenciadas terminalmente. El método combina dos pasos independientes que implican la inducción de un alto estado permisivo que se logra a través del borrado epigenético quím…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y MiND FoodS Hub ID: 1176436. Todos los autores son miembros de la Acción COST CA16119 Guía y aptitud celular total 3-D in vitro (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referências
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
