エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略
Summary
ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。
Abstract
細胞表現型は、各技術に固有の利点および制限を有する、異なる方法で逆転または改変することができる。ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせた新しい戦略について説明します。主に 2 つの手順が必要です。第1のステップでは、成体成熟(末端分化)細胞をエピジェネティック消しゴム5-アザ-シチジンに曝露し、多能性状態に駆動する。プロトコルのこの部分は、細胞の運命と分化を制御するエピジェネティックなメカニズムの理解の高まりに基づいて開発され、エピジェネティック修飾剤を使用して細胞の分化状態を消去し、その後、一時的な高可塑性ウィンドウに駆動することを含む。
第2のステップでは、消去された細胞は、液体大理石としても知られるポリテトラフルオロエチレン(PTFE)マイクロバイオリアクターに封入され、3D細胞の再配列を促進し、獲得した高い可塑性を伸長および安定に維持する。PTFEは非反応性疎水性合成化合物であり、その使用は、従来の2D培養システムでは達成できない細胞微小環境の創出を可能にする。このシステムは、バイオメカノセンシング関連の手がかりを通じて多能性の維持を奨励し、促進する。
ここで説明する技術的手順は、成体体細胞における高い可塑性状態の誘導および維持を可能にするための単純な戦略である。このプロトコルは、試験したすべての哺乳動物種における可塑性の高い細胞の誘導を可能にした。遺伝子トランスフェクションの使用を伴わず、ウイルスベクターを含まないため、トランスレーショナルメディシンアプリケーションにとって顕著な技術的進歩を表す可能性があります。さらに、マイクロバイオリアクターシステムは、可塑性の高い細胞、すなわちESC、iPSC、エピジェネティックに消去された細胞およびMSCの長期培養を可能にする特定の微小環境をin vitroで再現することにより、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を提供する。
Introduction
過去数十年間、細胞の関与と分化に向けた一方向の進行という広く受け入れられている概念は完全に改訂されました。セルの仕様を逆転させることができ、最終分化したセルを、異なる方法を使用して、あまりコミットされず、より高い許容状態にプッシュできることが実証されています。
提案されているいくつかの方法の中で、最も有望な方法の1つは、いわゆる化学的に誘導された多能性に細胞を誘導するための化合物の使用を含む。このアプローチで使用される小分子は、成体成熟細胞のエピジェネティックなシグネチャーと相互作用および修飾することができ、トランスジェニックおよび/またはウイルスベクター1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の必要性を回避することができる。.多数の研究が最近、高メチル化遺伝子の再活性化を誘導する特定の生化学的および生物学的刺激を提供することによって、細胞をある表現型から別の表現型に切り替えることが可能であることを示している11、12、13、14、15。これらの脱メチル化事象は、最終分化細胞を原始的前駆細胞、多能性または高可塑性/多能性細胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10に変換することを可能にする。
並行して、多くの研究は最近、機械化関連の手がかりの理解、より具体的には、機械的力を使用して細胞の可塑性および/または分化に直接影響を与える可能性に焦点を当てている16,17,18,19。実際、細胞外マトリックス(ECM)が細胞運命の制御において重要な役割を果たしていることが明確に実証されている。特に、ECMによって産生される生体力学的および生物物理学的シグナルは、分子機構およびシグナル伝達経路を直接調節し、細胞の挙動および機能に影響を及ぼす20、21。これらの最近のデータは、in vivo細胞微小環境をより厳密に模倣し、細胞挙動を駆動する機械的および物理的刺激を複製する新しい3D培養システムの開発への道を開いた。
ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりの使用を組み合わせた2段階のプロトコルについて説明します。第1の工程では、細胞を脱メチル化分子5−アザ−シチジン(5−アザ−CR)と共にインキュベートする。この薬剤は、直接テン-イレブン転座2(TET2)媒介作用8,10およびDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)22,23の間接阻害の併用効果を通じて、有意なグローバルDNA脱メチル化を誘導することができる。この工程は、多能性関連遺伝子発現のその後の再活性化を伴うエピジェネティックブロックの除去を誘導し、したがって、可塑性の高い細胞1、2、3、8、10、以下「エピジェネティック消去細胞」という。第2のステップでは、細胞は3D培養系に封入される。この目的のために、非反応性疎水性合成化合物ポリテトラフルオロエチレン(PTFE;粒径1μm)がマイクロバイオリアクターとして使用され、従来の2D培養システム10の使用によって達成不可能な細胞微小環境の創造を可能にする。PTFE粉末粒子は、細胞が再懸濁され、液体コアを支持表面から隔離する液体滴の表面に付着し、内部液体と周囲環境24との間のガス交換を可能にする。このようにして得られた「PTFEマイクロバイオリアクター」は、「液体大理石」とも呼ばれ、細胞同士の自由な相互作用を促し、3D細胞再構成25,26,27を促進し、バイオメカノセンシング関連の手がかり10を通じて獲得した高い可塑性状態を延長し、安定に維持する。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去数十年間、いくつかの研究は、終末分化した細胞をあまりコミットされておらず、より高い許容状態に戻すための戦略の開発に焦点を当てていました。ここに記載されるプロトコルは、成体成熟末端分化細胞から始まる多能性細胞の生成および長期維持を可能にする。この方法は、化学的エピジェネティック消去およびその後の3D培養システムを使用して保証されるその維持によって達?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Carraresi FoundationとMiND FoodS Hub ID:1176436から資金提供を受けました。著者らは全員、COST Action CA16119 In vitro 3-D Total cell guidance and fit(CellFit)のメンバーである。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referências
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