Двухэтапная стратегия, которая сочетает эпигенетическую модификацию и биомеханические сигналы для создания плюрипотентных клеток млекопитающих
Summary
Здесь мы представляем метод, который сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для эффективной генерации плюрипотентных клеток млекопитающих без необходимости трансфекции генов или ретровирусных векторов. Таким образом, эта стратегия является многообещающей для трансляционной медицины и представляет собой заметный прогресс в технологии органоидных стволовых клеток.
Abstract
Клеточный фенотип может быть изменен или модифицирован различными методами, с преимуществами и ограничениями, которые специфичны для каждой техники. Здесь мы описываем новую стратегию, которая сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для создания плюрипотентных клеток млекопитающих. Необходимо сделать два основных шага. На первом этапе взрослые зрелые (терминально дифференцированные) клетки подвергаются воздействию эпигенетического ластика 5-аза-цитидина, чтобы привести их в плюрипотентное состояние. Эта часть протокола была разработана на основе растущего понимания эпигенетических механизмов, контролирующих судьбу и дифференцировку клеток, и включает в себя использование эпигенетического модификатора для стирания дифференцированного состояния клеток, а затем вгоняет в переходное окно высокой пластичности.
На втором этапе стертые клетки инкапсулируют в микробиореакторы политетрафторэтилена (PTFE), также известные как жидкие шарики, для содействия перегруппировке 3D-клеток для расширения и стабильного поддержания приобретенной высокой пластичности. PTFE является нереакционноспособным гидрофобным синтетическим соединением, и его использование позволяет создать клеточную микросреду, которая не может быть достигнута в традиционных системах 2D-культур. Эта система поощряет и повышает поддержание плюрипотентности с помощью сигналов, связанных с биомеханозонированием.
Технические процедуры, описанные здесь, представляют собой простые стратегии, позволяющие индукции и поддерживать состояние высокой пластичности во взрослых соматических клетках. Протокол позволил получить клетки высокой пластичности у всех протестированных видов млекопитающих. Поскольку он не связан с использованием трансфекции генов и свободен от вирусных векторов, он может представлять собой заметный технологический прогресс для применения в трансляционной медицине. Кроме того, система микробиореакторов обеспечивает заметный прогресс в технологии органоидов стволовых клеток путем воссоздания in vitro специфической микросреды, которая позволяет проводить долгосрочную культивирование клеток с высокой пластичностью, а именно в виде ЭСК, иПСК, эпигенетически стертых клеток и МСК.
Introduction
В течение последних десятилетий широко распространенная концепция однонаправленной прогрессии в направлении клеточной приверженности и дифференцировки была полностью пересмотрена. Было продемонстрировано, что спецификация ячейки может быть обращена вспять, и терминально дифференцированная клетка может быть подтолкнута к менее зафиксированному и более высокому разрешительному состоянию, используя различные методы.
Среди нескольких предложенных способов один из наиболее перспективных методов включает использование химических соединений для индуцирования клеток в так называемую химически индуцированную плюрипотентность. Малые молекулы, используемые в этом подходе, способны взаимодействовать и модифицировать эпигенетическую сигнатуру взрослой зрелой клетки, избегая необходимости в любом трансгенном и/или вирусном векторе 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многочисленные исследования недавно показали, что можно переключать клетки с одного фенотипа на другой, предоставляя специфические биохимические и биологические стимулы, которые индуцируют реактивацию гиперметилированных генов 11,12,13,14,15. Эти события деметилирования позволяют превращать терминально дифференцированные клетки в примитивный предшественник, мультипотентную или высокопластичную/плюрипотентную клетку 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Параллельно многие исследования в последнее время сосредоточены на понимании сигналов, связанных с механозондированием, и, более конкретно, на возможности использования механических сил для непосредственного влияния на пластичность и/или дифференцировку клеток 16,17,18,19. Действительно, было ясно продемонстрировано, что внеклеточный матрикс (ECM) играет ключевую роль в контроле судьбы клеток. В частности, биомеханические и биофизические сигналы, производимые ECM, непосредственно регулируют молекулярные механизмы и сигнальные пути, влияя на поведение и функции клеток20,21. Эти последние данные проложили путь к разработке новых систем 3D-культур, которые более точно имитируют микросреду клеток in vivo, воспроизводя механические и физические стимулы, определяющие поведение клеток.
Здесь мы описываем двухэтапный протокол, который сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для генерации плюрипотентных клеток млекопитающих. На первом этапе клетки инкубируют с деметилирующей молекулой 5-аза-цитидин (5-аза-CR). Этот агент способен индуцировать значительное глобальное деметилирование ДНК посредством комбинированного эффекта прямого действия 8,10, опосредованного транслокацией 2 (TET2) и косвенного ингибирования ДНК-метилтрансфераз (DNMT)22,23. Этот этап индуцирует удаление эпигенетических блоков с последующей реактивацией экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, и, следовательно, генерацию клеток высокой пластичности 1,2,3,8,10, далее именуемых «эпигенетически стертыми клетками». На втором этапе клетки инкапсулируются в систему 3D-культуры. С этой целью в качестве микробиореактора используется нереакционноспособное гидрофобное синтетическое соединение политетрафторэтилен (PTFE; с размером частиц 1 мкм), что позволяет создать клеточную микросреду, недостижимую с помощью традиционных 2D-культуральных систем10. Частицы порошка PTFE прилипают к поверхности капли жидкости, в которой клетки повторно суспендируются, и изолируют жидкое ядро от опорной поверхности, обеспечивая при этом газообмен между внутренней жидкостью и окружающей средой24. Полученный таким образом «микробиореактор PTFE», также известный как «Жидкий мрамор», побуждает клетки свободно взаимодействовать друг с другом, способствуя 3D-перегруппировке клеток 25,26,27, а также расширяет и стабильно поддерживает приобретенное состояние высокой пластичности через биомеханозондирующие сигналы 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
В течение последних десятилетий несколько исследований были сосредоточены на разработке стратегий возврата терминально дифференцированной клетки к менее приверженному и более высокому разрешительному состоянию. Описанный здесь протокол позволяет генерировать и длительно поддерж?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Фондом Каррарези и MiND FoodS Hub ID: 1176436. Все авторы являются членами COST Action CA16119 In vitro 3-D общее руководство клетками и фитнес (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referências
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
