Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif
Summary
La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.
Abstract
Bien que les petits ARN régulateurs (ARNs) soient répandus dans le domaine bactérien de la vie, les fonctions de beaucoup d’entre eux restent mal caractérisées notamment en raison de la difficulté d’identifier leurs cibles d’ARNm. Ici, nous avons décrit un protocole modifié de la purification par affinité MS2 couplé à la technologie de séquençage de l’ARN (MAPS), visant à révéler tous les partenaires ARN d’un ARN spécifique in vivo. En gros, l’aptamère MS2 est fusionné à l’extrémité 5′ de l’ARNr d’intérêt. Cette construction est ensuite exprimée in vivo, permettant à l’ARNsM2 d’interagir avec ses partenaires cellulaires. Après la récolte bactérienne, les cellules sont lysées mécaniquement. L’extrait brut est chargé dans une colonne de chromatographie à base d’amylose préalablement recouverte de la protéine MS2 fusionnée à la protéine de liaison au maltose. Cela permet la capture spécifique de l’ARNs MS2 et des ARN en interaction. Après l’élution, les ARN co-purifiés sont identifiés par séquençage de l’ARN à haut débit et analyse bioinformatique ultérieure. Le protocole suivant a été mis en œuvre dans l’agent pathogène humain à Gram positif Staphylococcus aureus et est, en principe, transposable à toute bactérie à Gram positif. En résumé, la technologie MAPS constitue une méthode efficace pour explorer en profondeur le réseau de régulation d’un ARNr particulier, offrant un instantané de l’ensemble de son targetome. Cependant, il est important de garder à l’esprit que les cibles putatives identifiées par MAPS doivent encore être validées par des approches expérimentales complémentaires.
Introduction
Des centaines, voire des milliers de petits ARN régulateurs (ARNs) ont été identifiés dans la plupart des génomes bactériens, mais les fonctions de la grande majorité d’entre eux restent inhabituelles. Dans l’ensemble, les ARNs sont de courtes molécules non codantes, jouant un rôle majeur dans la physiologie bactérienne et l’adaptation aux environnements fluctuants1,2,3. En effet, ces macromolécules sont au centre de nombreux réseaux de régulation complexes, impactant les voies métaboliques, les réponses au stress mais aussi la virulence et la résistance aux antibiotiques. Logiquement, leur synthèse est déclenchée par des stimuli environnementaux spécifiques (p. ex. privation de nutriments, stress oxydatif ou membranaire). La plupart des ARNm régulent plusieurs ARNm cibles au niveau post-transcriptionnel par le biais d’appariements de bases courts et non contigus. Ils empêchent généralement l’initiation de la traduction en concurrençant les ribosomes pour les régions d’initiation de la traduction4. La formation de duplex ARNm:ARNm entraîne aussi souvent la dégradation active de l’ARNm cible par le recrutement de RNases spécifiques.
La caractérisation d’un targetome d’ARNs (c’est-à-dire l’ensemble de ses ARN cibles) permet d’identifier les voies métaboliques dans lesquelles il intervient et le signal potentiel auquel il répond. Par conséquent, les fonctions d’un ARNr spécifique peuvent généralement être déduites de son targetome. A cet effet, plusieurs outils de prédiction in silico ont été développés tels que IntaRNA et CopraRNA5,6,7. Ils s’appuient notamment sur la complémentarité des séquences, l’énergie d’appariement et l’accessibilité du site d’interaction potentiel pour déterminer les partenaires d’ARNs putatifs. Cependant, les algorithmes de prédiction n’intègrent pas tous les facteurs influençant l’appariement de bases in vivo tels que l’implication d’ARN chaperons8 favorisant des interactions sous-optimales ou la co-expression des deux partenaires. En raison de leurs limites inhérentes, le taux de faux positifs des outils de prédiction reste élevé. La plupart des approches expérimentales à grande échelle sont basées sur la co-purification des couples ARNs:ARNm interagissant avec une protéine de liaison à l’ARN marqué (RBP)6,9. Par exemple, la méthode RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) a identifié des duplex d’ARN co-purifiés avec des chaperons d’ARN tels que Hfq et ProQ dans Escherichia coli10,11. Une technologie similaire appelée UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) a été appliquée aux ARNs associés à la RNase E- et Hfq dans E. coli12,13. Malgré les rôles bien décrits de Hfq et ProQ dans la régulation par l’ARN dans plusieurs bactéries8,14,15,la régulation basée sur l’ARNs semble être indépendante de l’ARN chez plusieurs organismes comme S. aureus16,17,18. Même si la purification des duplex d’ARN en association avec les RNases est possible comme démontré par Waters et ses collègues13,cela reste délicat car les RNases déclenchent leur dégradation rapide. Par conséquent, l’approche MS2-Affinity Purification couplée au Séquençage de l’ARN (MAPS)19,20 constitue une alternative solide chez de tels organismes.
Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, MAPS utilise un ARN spécifique comme appât pour capturer tous les ARN en interaction et ne repose donc pas sur l’implication d’un RBP. L’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En bref, l’ARNs est marqué au 5′ avec l’aptamère à ARN MS2 qui est spécifiquement reconnu par la protéine ms2. Cette protéine est fusionnée avec la protéine de liaison au maltose (MBP) pour être immobilisée sur une résine amylose. Par conséquent, l’ARNsM2 et ses partenaires ARN sont retenus sur la colonne de chromatographie d’affinité. Après élution avec du maltose, les ARN co-purifiés sont identifiés à l’aide d’un séquençage d’ARN à haut débit suivi d’une analyse bioinformatique(Figure 2). La technologie MAPS dessine finalement une carte en interaction de toutes les interactions potentielles se produisant in vivo.
La technologie MAPS a été mise en œuvre à l’origine dans la bactérie Gram négatif non pathogène E. coli21. Remarquablement, MAPS a aidé à identifier un fragment dérivé de l’ARNt interagissant spécifiquement avec les ARNs RyhB et RybB et empêchant tout bruit transcriptionnel de l’ARNr pour réguler les cibles de l’ARNm dans des conditions non induisantes. Par la suite, maps a été appliqué avec succès à d’autres ARNs de E. coli comme DsrA22,RprA23,CyaR23 et GcvB24 (Tableau 1). En plus de confirmer des cibles précédemment connues, MAPS a étendu le targetome de ces ARNs bien connus. Récemment, MAPS a été réalisée dans Salmonella Typhimurium et a révélé que l’ARNs SraL se lie à l’ARNm rho, codant pour un facteur de terminaison de transcription25. Grâce à cet appariement, SraL protège l’ARNm rho de l’arrêt prématuré de la transcription déclenché par Rho lui-même. Fait intéressant, cette technologie n’est pas limitée aux ARNs et peut être appliquée à n’importe quel type d’ARN cellulaires comme l’illustre l’utilisation d’un fragment dérivé de l’ARNt26 et d’une région non traduite 5′-de l’ARNm22 (Tableau 1).
La méthode MAPS a également été adaptée à la bactérie pathogène à Gram positif S. aureus19. Plus précisément, le protocole de lyse a été largement modifié pour briser efficacement les cellules en raison d’une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif et pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Ce protocole adapté a déjà démêlé l’interactome de RsaA27,RsaI28 et RsaC29. Cette approche a donné des aperçus sur le rôle crucial de ces ARNs dans les mécanismes de régulation des propriétés de surface cellulaire, de l’absorption de glucose, et des réponses oxydantes de stress.
Le protocole élaboré et mis en œuvre dans E. coli en 2015 a récemment été décrit en détail30. Ici, nous fournissons le protocole MAPS modifié, qui est particulièrement adapté à l’étude des réseaux de régulation de l’ARNs chez les bactéries Gram-positives (paroi cellulaire plus épaisse), qu’elles soient non pathogènes ou pathogènes (précautions de sécurité).
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole modifié pour les bactéries à Gram positif
Le protocole initial de MAPS a été développé pour étudier l’interactome de l’ARNs dans l’organisme modèle E. coli20,30. Ici, nous décrivons un protocole modifié qui convient à la caractérisation des réseaux de régulation ARN-dépendants dans l’agent pathogène humain opportuniste S. aureus et est certainement transposable à d’autres bactéries Gr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, Subvention ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, et ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, à PR). Il a également été publié dans le cadre du labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 et de l’ANR-17-EURE- 0023 (à PR), en tant que financement de l’État géré par ANR dans le cadre des investissements pour le futur programme. DL a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 753137-SaRNAReg. Les travaux du laboratoire E. Massé ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de la subvention d’équipe R01 GM092830-06A1 des NIH des National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
Referências
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