Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi
Summary
La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L’sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell’RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.
Abstract
Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l’obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l’aptamero MS2 è fuso all’estremità 5 ‘ dell’sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all’MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L’estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l’acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l’eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell’RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell’agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un’istantanea dell’intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.
Introduction
Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell’adattamento agli ambientifluttuanti1,2,3. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l’accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l’avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione allatraduzione 4. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell’mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.
La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l’intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l’identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull’accoppiamento dell’energia e sull’accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l’accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones8 favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall’RNA in diversi organismi come S. aureus16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi13, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l’approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.
A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L’intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l’sRNA viene taggato a 5′ con l’aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l’eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell’RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.
La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli21. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione25. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall’uso di un frammento derivato da tRNA26 e di una regione non tradotta di 5’di mRNA22 (Tabella 1).
Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus19. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l’integrità dell’RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l’interactome di RsaA27,RsaI28 e RsaC29. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell’assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.
Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio30. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi
Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l’interactoma dello sRNA nell’organismo modello E. coli20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall’sRNA nell’opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH e ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). È stato anche pubblicato nell’ambito del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e di ANR-17-EURE- 0023 (a PR), come finanziamento dallo Stato gestito da ANR nell’ambito degli investimenti per il futuro programma. DL è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 753137-SaRNAReg. Il lavoro in E. Massé Lab è stato supportato da sovvenzioni operative del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e del National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
Referências
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