Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas
Summary
A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.
Abstract
Embora os PEQUENOs RNAs regulatórios (sRNAs) sejam difundidos entre o domínio bacteriano da vida, as funções de muitos deles permanecem pouco caracterizadas notavelmente devido à dificuldade de identificar seus alvos de mRNA. Aqui, descrevemos um protocolo modificado da Purificação MS2-Affinity, juntamente com a tecnologia RNA Sequencing (MAPS), com o objetivo de revelar todos os parceiros de RNA de um sRNA in vivo específico. Em linhas gerais, o aptamer MS2 é fundido à extremidade de 5′ do sRNA de interesse. Essa construção é então expressa in vivo, permitindo que o MS2-sRNA interaja com seus parceiros celulares. Após a colheita bacteriana, as células são mecanicamente cultivadas. O extrato bruto é carregado em uma coluna de cromatografia à base de amilolose previamente revestida com a proteína MS2 fundida à proteína de ligação maltosa. Isso permite a captura específica de MS2-sRNA e RNAs interagindo. Após a elução, os RNAs co-purificados são identificados por sequenciamento de RNA de alto rendimento e análise bioinformática subsequente. O protocolo a seguir foi implementado no Patógeno Humano Gram-positivo Staphylococcus aureus e é, em princípio, transposável para qualquer bactéria Gram-positiva. Resumindo, a tecnologia MAPS constitui um método eficiente para explorar profundamente a rede regulatória de um sRNA específico, oferecendo um instantâneo de todo o seu targetome. No entanto, é importante ter em mente que as metas putativas identificadas pelo MAPS ainda precisam ser validadas por abordagens experimentais complementares.
Introduction
Centenas, talvez até milhares de pequenas RNAs regulatórias (sRNAs) foram identificadas na maioria dos genomas bacterianos, mas as funções da grande maioria deles permanecem descaracterizadas. No geral, as sRNAs são moléculas curtas sem codificação, desempenhando papéis importantes na fisiologia bacteriana e adaptação a ambientes flutuantes1,2,3. De fato, essas macromoléculas estão no centro de inúmeras redes regulatórias intrincadas, impactando vias metabólicas, respostas ao estresse, mas também virulência e resistência a antibióticos. Logicamente, sua síntese é desencadeada por estímulos ambientais específicos (por exemplo, fome de nutrientes, estresse oxidativo ou membrana). A maioria dos sRNAs regulam mRNAs de alvo múltiplos no nível pós-transcrição através de emparelhamento de base curto e não contíguo. Eles geralmente impedem a iniciação da tradução competindo com ribossomos para as regiões de iniciação de tradução4. A formação de duplexes sRNA:mRNA também frequentemente resulta na degradação ativa do mRNA alvo por meio do recrutamento de RNases específicos.
A caracterização de um targetome sRNA (ou seja, todo o conjunto de suas RNAs alvo) permite a identificação das vias metabólicas nas quais ele intervém e o sinal potencial a que responde. Consequentemente, as funções de um sRNA específico geralmente podem ser inferidas a partir de seu targetome. Para isso, várias ferramentas de previsão de silico foram desenvolvidas, como IntaRNA e CopraRNA5,6,7. Eles notavelmente contam com complementaridade de sequência, emparelhamento de energia e acessibilidade do potencial local de interação para determinar parceiros de sRNA putativos. No entanto, os algoritmos de previsão não integram todos os fatores que influenciam o emparelhamento de base in vivo, como o envolvimento de acompanhantesrna 8 favorecendo interações sub-ideais ou a co-expressão de ambos os parceiros. Devido às suas limitações inerentes, a taxa falsa positiva de ferramentas de predição permanece alta. A maioria das abordagens experimentais em larga escala baseia-se na co-purificação de casais sRNA:mRNA interagindo com uma proteína de ligação de RNA (RBP)6,9. Por exemplo, o método RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identificou duplexes RNA co-purificados com acompanhantes de RNA como Hfq e ProQ em Escherichia coli10,11. Uma tecnologia semelhante chamada UV-Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids (CLASH) foi aplicada aos SRNAs associados ao RNase E e Hfq em E. coli12,13. Apesar dos papéis bem descritos do Hfq e do ProQ na regulação mediada pelo SRNA em múltiplas bactérias8,14,15, a regulamentação baseada em sRNA parece ser independente de RNA em vários organismos como S. aureus16,17,18. Mesmo que a purificação dos duplexes de RNA em associação com rnases seja viável, como demonstrado por Waters e colegas de trabalho13,isso permanece complicado à medida que as RNases desencadeiam sua rápida degradação. Assim, a Purificação MS2-Affinity juntamente com a abordagem RNA Sequencing (MAPS)19,20 constitui uma alternativa sólida nesses organismos.
Ao contrário dos métodos acima mencionados, o MAPS usa um sRNA específico como isca para capturar todos os RNAs interagindos e, portanto, não depende do envolvimento de um RBP. Todo o processo é retratado na Figura 1. Resumindo, o sRNA é marcado no 5′ com o aptamer MS2 RNA que é especificamente reconhecido pela proteína do casaco MS2. Esta proteína é fundida com a proteína de ligação maltosa (MBP) a ser imobilizada em uma resina de amilose. Portanto, o MS2-sRNA e seus parceiros RNA são mantidos na coluna de cromatografia de afinidade. Após a elução com maltose, os RNAs co-purificados são identificados utilizando-sequenciamento de RNA de alto rendimento seguido de análise bioinformática(Figura 2). A tecnologia MAPS acaba por desenhar um mapa interativo de todas as interações potenciais que ocorrem in vivo.
A tecnologia MAPS foi originalmente implementada na bactéria gram-negativa não patogênica E. coli21. Notavelmente, o MAPS ajudou a identificar um fragmento derivado de tRNA interagindo especificamente com os sRNAs ryhB e RybB e impedindo qualquer ruído transcricional sRNA para regular os alvos de mRNA em condições não indutoras. A partir daí, o MAPS foi aplicado com sucesso a outros E. coli sRNAs como DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (Tabela 1). Além de confirmar alvos previamente conhecidos, o MAPS estendeu o targetome desses sRNAs conhecidos. Recentemente, o MAPS foi realizado em Salmonella Typhimurium e revelou que o SRNA da SraL se liga ao rho mRNA, codificando para um fator de rescisão de transcrição25. Através deste emparelhamento, a SraL protege rho mRNA da rescisão de transcrição prematura desencadeada pela própria Rho. Curiosamente, essa tecnologia não se restringe aos sRNAs e pode ser aplicada a qualquer tipo de RNAs celular como exemplificado pelo uso de um fragmento derivado de tRNA26 e uma região não traduzida de 5′-untranslated de mRNA22 (Tabela 1).
O método MAPS também foi adaptado à bactéria gram-positiva patogênica S. aureus19. Especificamente, o protocolo de lise foi amplamente modificado para quebrar células eficientemente devido a uma parede celular mais espessa do que as bactérias Gram-negativas e para manter a integridade do RNA. Este protocolo adaptado já desvendou o interactome do RsaA27, RsaI28 e RsaC29. Essa abordagem deu insights sobre o papel crucial dessas sRNAs nos mecanismos regulatórios das propriedades da superfície celular, captação de glicose e respostas ao estresse oxidativo.
O protocolo desenvolvido e implementado em E. coli em 2015 foi recentemente descrito em grande detalhe30. Aqui, fornecemos o protocolo MAPS modificado, que é particularmente adequado para estudar redes reguladoras de sRNA em bactérias Gram-positivas (parede celular mais grossa), sejam elas não patogênicas ou patogênicas (precauções de segurança).
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo modificado para bactérias Gram-positivas
O protocolo inicial do MAPS foi desenvolvido para estudar o sRNA interactome no organismo modelo E. coli20,30. Aqui, descrevemos um protocolo modificado que é adequado para a caracterização de redes regulatórias dependentes de sRNA no patógeno humano oportunista S. aureus e é certamente transposável para outras bactérias Gram-positivas, patogênicas ou não.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, e ANR-18-CE12-0025-04, CoNoCo, to PR). Também foi publicado sob o âmbito do laboratórioEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e do ANR-17-EURE-0023 (para RP), como financiamento do Estado administrado pela ANR como parte dos investimentos para o futuro programa. A DL foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o Acordo de Subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 753137-SaRNAReg. O trabalho no E. Massé Lab tem sido apoiado por subvenções operacionais dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Nacionais de Saúde NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
Referências
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
